O-GlcNAc修饰在谷氨酰胺诱导热休克蛋白表达中作用研究

1、谷氨酰胺通过O-GlcNAc 修饰机制诱导热休克蛋白表达东南大学附属中大医院210009龚俊松，景亮【摘要】目的： 本研究观察谷氨酰胺(Gln)诱导热休克蛋白70( HSP70)表达对脂多糖(LPS)刺激乳鼠心肌细胞的保护作用及氧连-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰在 Gln 诱导 HSP70表达信号转导通路中的作用。方法： 原代培养SD 乳鼠心肌细胞后依据培养基内加入成分分五组：对照组(C 组)给予双蒸水；LPS组 (LPS 4ug/ml)； GL 组 (Gln 5mM +LPS 4ug/ml)； GLA 组 (Gln 5mM+LPS4ug/ml+Alloxan 1mM, Allox

2、an 为 O连 -N-乙酰葡萄糖胺氨基转移酶(OGT)抑制剂，能减少 O-GlcNAc 修饰水平)； GLP 组 (Gln 5mM+LPS 4ug/ml+PUGNAc 100uM,PUGNAc为 O-连 N-乙酰葡萄糖苷酶(OGA)抑制剂， 能增加 O-GlcNAc 修饰水平)。上述 5 组细胞孵育6h 后，以台盼蓝拒染法测定细胞生存率；比色法测定细胞培养液 LDH 水平(反映心肌细胞损伤情况)； Western Blotting 分析心肌细胞HSP70蛋白水平、胞核热休克因子-1( HSF-1)蛋白水平和O-GlcNAc 修饰水平；电泳迁徙率变动实验(electrophoretic mobi

3、lity shift assay， EMSA)测定心肌细胞核HSF-1 转录活性。结果：各组细胞生存率无显著性变化。结果： 与 C 组相比，LPS 组细胞损伤显著增加(p<.05)， 但在 Gln+LPS 组这种心肌细胞损伤得到明显恢复(p<.05)。与C 组相比，LPS 组的心肌细胞O-GlcNAc 修饰水平、HSP70蛋白表达、胞核HSF-1 蛋白表达及转录活性，明显增加(p<.05)； Gln+LPS 组的O-GlcNAc 修饰水平、HSP70蛋白表达、胞核 HSF-1 蛋白表达及转录活性与LPS组相比更进一步增加(p<.05)。 Gln 在 LPS刺激心肌细胞的

4、上述作用可为Alloxan完全抑制(GLA 组) ，同时也可为PUGNAc 所逆转 (GLP 组 ) 。 结论： LPS 刺激2乳鼠心肌细胞给予Gln 治疗， 可通过增加O-GlcNAc 修饰水平，增加核内转录因子 HSF-1 水平及转录活性，进而促进HSP70的蛋白表达。增强O 连 -N-乙酰葡萄糖胺氨基转移酶和O-连 N-乙酰葡萄糖苷酶活性可能是脓毒血症治疗的另一潜在治疗学靶点。【关键词】谷氨酰胺、O-GlcNAc 修饰、HSP70、 HSF-1【 Abstract】AIMS: To investigate the protective effect of glutamine-induce

5、d heat shock proteins(HSP) expression in LPS-treated rat cardiocytes and whether its possible molecular mechanisms are relative to enzyme activities of O-linked -N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) modification pathway.METHODS: Primary cultures of neonatal rat cardiocytes were divided into control (treat

6、ed with double distilled water), LPS (lipopolysaccharide, 4 g/ml),G ln+LPS (Gln 5mM+LPS 4 g/ml), Gln+LPS+Alloxa n(an inhibitor of O-linked -N-acetyl glucosamine transferase/OGT, 1mM), and Gln+LPS+PUGNAc (an inhibitor of O-linked -N-acetyl glucosaminidase/OGA, 1 M ) groups. A-fhteoru6r incubation, ce

7、ll viability was measured by Trypan blue exclusion method and cell necrosis was assessed by detecting the release of lactate dehydrogenase(LDH) in culture medium in all groups, respectively. The levels of HSP70 expression, endonuclear heat shock factor 1(HSF-1) expression, and O-GlcNAc modification

8、from cardiocytes were analyzed by Western blotting. HSF-1 transcriptional activity of cardiocytes was determined by electrophoretic mobility shift assay ( EMSA) in all groups, respectively. Data were presented as mean standard deviation. Statistical analysis 2were performed using one-way ANOVA. Stat

9、istical significance was assigned at a P value of less than 0.05.RESULTS: There were no significant differences in cell viability among five groups. LDH levels in culture medium were low in the control group but markedly increased in the LPS group (P<0.05). Treatment with Gln (Gln+LPS group) sign

10、ificantly decreasedL PS-induced cardiocytes damage (P<0.05), and this protective action by Gln could be mimicked with PUGNAc (in Gln+LPS+PUGNAc group) or banished with alloxan (in Gln+LPS+Alloxan group). HSP 70 levels, endonuclear HSF-1 levels, O-GlcNAc modification levels, and HSF-1 transcriptio

11、nal activity from cardiocytes were significantly increased in the LPS group compared with control group. Treatment with Gln (Gln+LPS group) further increased HSP70 levels, endonuclear HSF-1 levels, O-GlcNAc modification levels and HSF-1 transcriptional activity in cardiocytes (P<0.05). The above-

12、mentioned action by Gln also could be mimicked with PUGNAc (in Gln+LPS+PUGNAc group) or banished with alloxan (in Gln+LPS+Alloxan group) .CONCLUSION: Glutamine induces HSP expression and protects against LPS-induced necrosis in rat cardiocytes. The molecular mechanism of Gln-mediated HSP70 expressio

13、n appears to be dependent on the enzyme activities of O-GlcNAc pathway and that augmentation of enzyme activities may have potential therapeutic effects in sepsis.【 Key words】 Glutamine,O-GlcNAc modification, Heat shock protein 70,Heat shock factor-1谷氨酰胺(glutamine， Gln)是人血中含量最丰富的一种氨基酸，约占体内总游离氨基酸的50%

14、。 Gln 作为蛋白质和肽的组分，在参与机体新陈代谢，维持机体酸碱平衡，调控机体免疫机能，保护细胞及脏器功能等方面发挥了重要作用，被称为“条件必需氨基酸”【 1】。热休克蛋白(heat shock protein , HSP)是体内具有高度保守性的一类蛋白质，研究发现Gln 能诱导 HSP表达 【 2】【 3】， 我们前期研究也表明，Gln 能增加休克大鼠的HSP70 表达，减少炎症因子的释放，改善血管反应性 【 4】 ，但是机制未明。蛋白质氧连-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰是一种发生在细胞浆、细胞核内的糖基化方式，它是一种广泛的、动态的翻译后修饰现象，通过O 位糖苷键将单个N-乙

15、酰氨基葡萄糖连接到丝氨酸或苏氨酸的羟基上5。在 O-GlcNAc修饰过程中，OGT(N-乙酰葡萄糖胺糖基转移酶) 负责在裸露蛋白丝氨酸或苏氨酸的羟基上加上O 位糖基， Alloxon 为 OGT 酶抑制剂 【 6】 ； OGA (N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶，O-GlcNAcase) 负责将 O位糖基移除，PUGNAc 为 OGA 酶抑制剂 【 7】。在应激时，O 位糖基化能敏感地感受外界环境的变化，调节蛋白质的相互作用，在细胞信号转导、基因转录、翻译、细胞周期、应激及多种疾病中起重要调控作用 【 8】 。我们假设LPS 刺激乳鼠原代心肌细胞给予Gln 后能对细胞的O-GlcNAc 修饰水平产生影响

16、，并对HSP转录因子热休克转录因子1( HSF-1)产生影响，进而影响 HSP基因的表达，产生相应生物学效应。材料和方法：本实验涉及心肌细胞原代培养，需要使用新生乳鼠，实验经过东南大学动物伦理委员会的批准，严格执行动物保护相关条例。1 .心肌细胞培养：出生 48h 的 SD 乳鼠（东南大学动物中心），取心脏用酶消化法制备心肌细胞单细胞悬液，以差速贴壁法分离纯化心肌细胞，加入含10%小牛血清（杭州四季青）的高糖型MDEM （ GIBCO）培养液，按3*106个细胞/瓶接种于50ml培养瓶（Corning， USA） ，置于37含5%CO2培养箱中孵育，约3-4天后细胞至对数生长期，达到80%融合

17、，并出现明显的搏动现象，开始给予干预措施。实验分 5 组， C 组、 L 组、 GL 组、 GLA 组、 GLP 组，分别给与双蒸水50ul、Gln（ Amersham） 5mM、 LPS（ sigma） 4g/ml、 Gln 5mM+ LPS 4g/ml、 Gln 5mM+ LPS 4 g/ml +Alloxan 1mM ， Gln 5mM+ LPS 4g/ml +PUGNAc 100uM 。 继续培养 6h 后测定相关指标，并提取细胞蛋白。2 .心肌细胞生存率测定和细胞培养液LDH 活力测定：用台盼蓝拒染法测定上述各组干预后6h 心肌细胞生存率，取 10ul 细胞悬液混合混合0.04%台盼

18、蓝染色液，计数至少200个细胞计算细胞生存率。心肌细胞坏死时能释放LDH ， 故通过测定细胞培养液LDH 含量能一定程度反应细胞坏死情况，使用LDH 试剂盒（南京建成）以比色法测定相关数据，依据说明书公式计算出各组细胞培养液LDH 活力。3 .Western Blotting法测定干预后6h HSP70、HSF-1、 O-GlcNAc 蛋白含量水平：3.1 以各组细胞HSP70水平为例，细胞干预后6h使用细胞裂解液（P0013，Beyotime）于冰上裂解心肌细胞，高速离心取上清获得细胞总蛋白。HSP70 的测定采用变性SDS-PAGE法，各组样品加于事先制备好的SDS-PAGE凝胶，上层胶浓

19、度5%， 80V 电压通电约30min， 下层胶浓度8%， 120V电压通电约60min以分离蛋白。以半干转膜仪将凝胶上蛋白转移至PVDF 膜， 5%脱脂牛奶（光明牌，上海）封闭1h， 4下1： 5000 HSP70 小鼠单克隆抗体（ab5442， abcam,American）孵育过夜，用PBST洗膜约 10min*3-5 次， 1： 5000含辣根过氧化物酶的二抗孵育1h， 用 PBST洗膜约 10min*3-5 次， ECL法与含蛋白及抗体的PVDF膜反应，暗室压片曝光，洗出胶片。3.2 细胞核内HSF-1 蛋白的测量先用细胞核、细胞浆蛋白提取试剂盒（ P0027，Beyotime）提取

20、心肌细胞核蛋白，后续过程与HSP70 的测定相似。其一抗为大鼠 HSF-1 单克隆抗体（ab19913， abcam， American） ，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠IgG（ H+L） （ ZB2307，北京中山金桥）。3.30 -GlcNAc 蛋白水平测定采用非变性SDS-PAGE 法电泳分离蛋白，上层胶浓度5%，下层胶浓度6%，其余步骤与HSP70水平测定相似。其一抗为小鼠单克隆抗O-GlcNAc（ CTD110.6， abcam， American） ， 二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（ H+L） （ ZB2305，北京中杉金桥）。3.31 参选用抗Tubulin 小

21、鼠单克隆抗体（AT819， Beyotime） ，具体测量方法与 HSP70一致。所有实验至少重复三遍以上，各组实验得到的胶片用成像系统（Labworks，American）进行拍照，并采用totallab2.0（ Phoretix International， England）软件进行分析。4 .电泳迁移率变动实验（Electrophoretic mobility shift assay ， EMSA） ：该方法用来测定HSF-1 这一转录因子与其特定HSE 序列的结合活性。HSE探针采用如下序列GCCTCGATTGTTCGCGAAGTTTCG （上海生工生物公司合成） 。同位素使用 -32

22、PATP （5,000Ci/mmol at 10mCi/ml）（北京双源）， EMSA 步骤按照 EMSA/Gel-Shift 试剂盒（Beyotime）说明书进行，依次进行标记探针，配置 EMSA 胶， EMSA 结合反应等步骤。以0.5XTBE 作为电泳液进行电泳，所得凝胶紧贴胶片，于-80曝光24-72h，洗片并用成像系统拍照，totallab2.0Phoretix International， England)软件进行分析，通过比较各组条带灰度值HSF-1 转录活性。5 .统计学分析：所有数据均以均值标准差 (x s)表示，组间数据采用SPSS 15.0SPSS inc， Chicag

23、o)行单因素方差分析，采用Prism4.0软件(GraphPadsoftware， San Diego)作图，P< 0.05有统计学意义。1. 各组细胞不同干预后6h 细胞生存率及培养液LDH 活力变化21各组心肌细胞干预后6h 生存率无统计学差异。细胞培养液LDH 活力在一定程度上能反映心肌细胞的坏死情况。从Fig1 可以看出，与C 组相比，其余四组 L 组、 GL 组、 GLA 组、 GLP 组心肌细胞培养液LDH 活力明显增高（ P< 0.05，*表示） ；与 L 组相比， Gln 能减少心肌细胞LDH 释放（ GL 组，P< 0.05， $表示） 。与 GL 组相比，

24、 Alloxan 能使细胞培养液LDH 活力显著增高（GLA 组， P< 0.05， #表示）。2 .Gln 增强 LPS刺激心肌细胞HSP70蛋白表达水平、胞核HSF-1 水平及转录活性、 O-GlcNAc 修饰水平。从图 Fig2A 中可以看出，同 C 组相比，L、 GL 组 HSP70的表达水平都有不同程度的提高（P< 0.05，以 *表示） 。与 L 组相比， Gln 能显著提高HSP70的蛋白表达水平（ GL 组，P< 0.05， 以 $表示）。 为了弄清该机制，我们研究了HSP70的转录因子HSF-1 的表达情况。本实验HSP70的表达水平与心肌细胞核HSF-1水

25、平及转录活性有关。与C 组相比，L、 GL 组胞核 HSF-1 水平（ Fig2B）及转录活性（Fig2C）不同程度提高（P< 0.05，以*表示） 。与 L 组相比， GL 组胞核HSF-1 水平及转录活性增强（P< 0.05，以$表示）。图 Fig2D 反映心肌细胞O-GlcNAc 修饰水平，图中从低分子量到高分子量蛋白中许多蛋白质都存在O-GlcNAc 修饰现象，故整张胶片上出现多处条带。将整张胶片取五处样，分别测定灰度值，相加后再予以标化来表明每组的O-GlcNAc 修饰水平。与 C 组相比， L 组及 GL 组的 O位糖基化修饰水平都有不同程度的升高。与L 组相比， GL

26、 组 O-GlcNAc 蛋白表达水平进一步提高（P<0.05，以$表示）。上述结果与干预后HSP70蛋白水平的变化趋势保持一致，这一点似乎暗示O-GlcNAc 修饰水平与HSP70的表达水平具有某种联系。3 .Alloxan、 PUGNAc 干预后各组细胞O-GlcNAc、 HSP70蛋白水平及胞核HSF-1蛋白表达水平为了进一步探讨O-GlcNAc 修饰在 Gln 诱导 HSP70表达机制中的作用，我们在 GL 组的基础上运用了对O-GlcNAc 糖基化关键酶产生作用的药物Alloxan、PUGNAc。 其中Alloxan 为 OGT 酶抑制剂，PUGNAc 为 OGA 酶抑制剂。从

27、Fig2D可以看出，在给予Alloxan 后心肌细胞O-GlcNAc 修饰水平显著减少（P< 0.05，以 #表示），在给予PUGNAc 后 O-GlcNAc 修饰水平显著提高（P< 0.05，以#表示） 。与此同时，心肌细胞核HSF-1 水平（ Fig2B）及转录活性（Fig2C）在给予O-GlcNAc 糖基化关键酶抑制剂后也发生变化，给予Alloxan 后，心肌细胞核内HSF-1 表达水平降低，转录活性降低（P< 0.05，以#表示）；给予 PUGNAc 后心肌细胞胞核HSF-1 水平增高，转录活性提高，其差异有统计学意义（P< 0.05，以 #表示）。 HSP70

28、的变化趋势（ Fig2A） 与心肌细胞核内HSF-1 表达水平 （ Fig2B）一致， GLA 组 HSP70水平明显减低，GLP 组 HSP70水平明显升高，其差异有统计学意义（P< 0.05，以#表示）。热休克反应作为生物界普遍存在的保护机制，越来越受到研究者的关注。Gln 能诱导 HSP70 表达，产生炎症因子，【 4】 。 Gln 作为一种安全、有效的热休克蛋白表达诱导剂已成为学【 2】 【 4】 ，但是具体机制未明。本实验各组细胞生存率都在95%以上，经统计学分析无显著性差异，一方Alloxan、PUGNAc 的浓度相对安全。LDH 是重要的心肌细胞酶，心肌细胞坏死时，LDH故

29、测定心肌细胞培养液LDH 活力能在一定程度上反应心本实验中，LPS 可造成严重心肌细胞损伤。同时给予Gln、 LPSLPS 造成的 LDH 释放。表明Gln 对 LPS 刺激心肌细胞有一定Gln 诱导HSP70表达有一定的联系。HSP70作为一种保护对心肌细胞的生存状态起到一定的改善。GL 组 HSP70水平提升幅度较L 组高， 说明 Gln 能进一步诱发LPS刺激下心肌细胞的HSP70表达， 发挥 HSP70对心肌细胞的保护作用，这一结果与先前我科的实验结果及Sanders【 3】 等人研究果蝇 Kc 细胞时的发现是一致的。并且高水平的HSP70能一定程度减轻细胞损伤，减少LDH 释放。在此

30、基础上，我们进一步证实，HSP70表达的增多与其关键转录因子HSF-1 表达水平有关。HSF-1 是 HSP70的重要转录因子，目前研究显示HSP在转录水平主要依靠HSF-1 调节 【 8】 。 正常情况下，HSF-1 以无活性的单体形式在细胞浆呈泛素化状态，应激后，游离的HSF-1 单体增多，这些游离的HSF-1 单体入核形成三聚体，磷酸化， 进而活性增强，与 HSP 基因转录必须的核苷酸序列HSE 结合， 促进 HSP基因的转录表达【 9】。 本文以 HSF-1 作为桥梁来研究Gln 在诱导 HSP70表达机制中的地位。通过分析实验结果，给予 Gln 能增加心肌细胞核HSF-1 的表达水平

31、，增强 HSF-1 转录活性，进而启动HSP70的转录翻译。心肌细胞胞核内HSF-1 水平和 HSF-1 活性从某种程度上决定了HSP70的表达水平。最近研究发现，Gln 能提高己糖胺合成途径（HBP）终产物UDP-GlcNAc的含量， 此物质同时也是O-GlcNAc 修饰的底物，能为 O-GlcNAc 修饰提供糖基【 10】 。 O-GlcNAc 修饰修饰的增多进而影响相关信号转导通路，并发挥相应生物学功能。 O-GlcNAc 修饰作为蛋白质翻译后修饰的一种重要形式，可作为细胞的“营养感受器”和 “应激感受器”【 11】 ， 调节细胞、蛋白、 转录因子的功能及活性。从 Fig2D 中可以看出

32、，Gln 可以提高LPS刺激心肌细胞O-GlcNAc 修饰水平，这与 HSF-1 及 HSP70 水平的变化趋势一致。上述结果提示Gln 有可能通过HBP途径，增加O-GlcNAc 修饰的底物UDP-GlcNAc 的含量，为O-GlcNAc 修饰提供糖基， 从而增加O-GlcNAc 修饰水平。近来有文章报道O-GlcNAc 修饰对SP1、NF B、 C-Jun 等转录因子活性起到明显作用11。因而我们推测Gln 可能通过O-GlcNAc 修饰这一感受器来影响转录因子HSF-1 的含量或转录活性，进而影响HSP70的表达。为了验证上述推测，我们使用了两个干预O-GlcNAc 修饰关键酶的抑制剂：

33、OGT 酶抑制剂Alloxan 和 OGA酶抑制剂PUGNAc。 作为 OGT酶抑制剂，Alloxan可降低 O-GlcNAc 修饰水平（GLA 组 ），并减少心肌细胞核内HSF-1 水平及转录活性， 减少 HSP70的蛋白水平，增加心肌细胞损伤。使用 OGA 酶抑制剂PUGNAc能提高心肌细胞O-GlcNAc 修饰水平（GLP 组） ，并能模拟Gln 的作用，增加心肌细胞核内HSF-1 水平及转录活性，增加HSP70的蛋白水平，减少心肌细胞损伤。 因而 O-GlcNAc 修饰对HSP70表达的影响主要是通过干预其转录因子HSF-1的核内水平及转录活性来实现的，结合 Gln 对 O-GlcNA

34、c 修饰的作用，我们不难发现 Gln 通过提高细胞O-GlcNAc 修饰水平来诱导HSP70的表达。我们进一步推测干预O-GlcNAc 修饰水平、调控 O-GlcNAc 糖基化的关键酶可能成为休克治疗的新靶点。当然， 休克需要综合治疗，综合分析，对于 O-GlcNAc 修饰与 HSP表达的机制仍然需要我们进一步评价。结论：LPS刺激心肌细胞给予Gln 后， 可以通过HBP途径增加UDP-GlcNAc 含量，干预 O-GlcNAc 糖基化的关键酶位点，从而增强心肌细胞O-GlcNAc 修饰水平，增加细胞核内HSF-1 含量及转录活性，进而促进HSP70的蛋白表达，并对心肌细胞产生保护作用。鸣谢：

35、本实验受到江苏省自然科学基金的资助，项目编号：BK2008303。 在此表示感谢！ 参考文献：【 1 Juliann G K, George C T. Heat shock protein 70 kDa :molecular biology , biochemistry , and physiologyJ . Pharmacol Ther , 1998 , 80 (2) : 1832201.【 2 Paul E.Wischmeyer. Glutumine and Heat Shock Protein Expression. Nutrition. 2002.18.225-228.【 3 Sand

36、ers M M, Kon C. Glutamine is a powerful effector of heat shock protein expression in Drosophila Kc cells J . J Cell Physiol , 199 , 146 : 180【 4 Liang Jing, Qiong Wu and Fuzhou Wang.Glutamine induces heat-shock protein and protects against Escherichia coli lipopolysaccharide-induced vascular hyporeactivity in rats.Critical Care 2007, 11:R34【 5 Gerald W.Hart, Michael P. Housley. Cycling of O-linked -N-acetylglucosamine on nucleocytoplasmic proteins NATURE, Vol 446,26 April.2007【 6 Robert J. Konrad,a Fengxue Zhang,Alloxan is an inhibitor of the enzyme O-linked N-acetylglucosamine