[自然科学]第九章 蛋白质的测定ppt课件

1、第九章第九章 蛋白质的测定蛋白质的测定王建龙王建龙食品科学与工程学院食品科学与工程学院第九章第九章 重点重点 凯氏定氮法原理、分步、测定方法。凯氏定氮法原理、分步、测定方法。 双缩脲法测定原理。双缩脲法测定原理。 氨基酸总量的测定方法甲醛滴定法。氨基酸总量的测定方法甲醛滴定法。一、概述1、食品中的蛋白质含量 各种不同食品的蛋白质含量各不一样，普通动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。 食品中的蛋白质含量食品中的蛋白质含量(g/100g)牛肉 猪肉 兔肉 鸡肉 20 9.5 21 20大豆 米 面粉 菠菜 苹果 40 8.5 10 2.4 0.42、蛋白质的生理功用及在食品中的作用3、蛋白质系数

2、 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，普通蛋白质含氮量为16，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值6.25称为蛋白质系数，不同种类食品的蛋白质系数有所不同。样品蛋白质系数样品蛋白质系数小麦粉及其制品5.70畜禽肉及其制品6.25全麦5.83芝麻5.30大米5.95乳类6.38花生5.46黄豆5.71二、测定方法蛋白质测定方法凯氏定氮法蛋白质快速测定法一凯氏定氮法一凯氏定氮法GB/T 5009.5-2003) 凯氏定氮法是经过测出样品中的总含氮量凯氏定氮法是经过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有少量非蛋白质含量，由于样品

3、中含有少量非蛋白质, ,用凯用凯氏定氮法经过测总氮量来确定蛋白质含量，氏定氮法经过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物，以及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。所以这样的测定结果称为粗蛋白。The Kjeldahl Procedure凯氏法的程序凯氏法的程序 1. Digestion step消化2. Distillation step蒸馏3. Titration step滴定1、原理 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+1

4、6H2O 消化 (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O 蒸馏滴定 4225)(5)(423342742427424333BOHClNHHClOHOBNHOHOBNHBOHNH浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又具有氧化性氮。浓硫酸又具有氧化性,将有机物炭化后的碳化为二将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸那么被复原成二氧化硫。氧化碳，硫酸那么被复原成二氧化硫。 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO22、仪器凯氏烧瓶、可调式电炉、蒸汽蒸馏安装3、试剂1硫酸铜CuSO45H2O；2硫酸钾；3浓硫酸:

5、密度为1.8419 g/L4氢氧化钠溶液:400g/L5)硼酸溶液:20g/L6 6 0.05 mol 0.05 molL L盐酸规范滴定溶液盐酸规范滴定溶液 7 795%95%乙醇。乙醇。8 8混合指示液混合指示液:1:1份甲基红乙醇溶液份甲基红乙醇溶液(1 g/L)(1 g/L)与与5 5份溴甲酚绿乙醇溶液份溴甲酚绿乙醇溶液(1 g/L)(1 g/L)临用时混合。也可临用时混合。也可用用2 2份甲基红乙醇溶液份甲基红乙醇溶液(1 g/L)(1 g/L)与与1 1份亚甲基蓝乙份亚甲基蓝乙醇溶液醇溶液(1 g/L)(1 g/L)临用时混合。临用时混合。甲基红-溴甲酚绿 pH 5.0 以下为暗红

6、色，pH 5.1 为灰绿色， pH 5.2 以上为绿色。 甲基红-亚甲基蓝混合指示液： 变色点pH=5.4，5.2红紫5.4灰蓝5.6绿， 4、操作方法 样品消化蒸馏滴定1样品消化样品+0.2g硫酸铜+6g硫酸钾+20ml浓硫酸+玻珠数粒先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟45度角消化终点瓶口不能对着人盖上小漏斗2 2蒸馏蒸馏按以下图衔接好蒸馏安装图加水至2/3体积处，加数滴甲基橙指示剂和硫酸几毫升，使水呈酸性夹紧螺旋夹加热蒸汽发生瓶中的水，检查整套安装能否有漏气景象，不能漏气。水蒸气与生成的氨气共沸，不断移除氨气，使反响继续。2 2蒸馏蒸馏将消化液全部转移到1

7、00ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示剂23d参与NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色通入蒸汽开场蒸馏冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反响室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内参与10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反响室，立刻塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接纳瓶，封锁电源3 3滴定滴定 取下接纳瓶，用取下接纳瓶，用0.1000mol/L0.1000mol/L的盐酸或硫的盐酸或硫酸规范溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。酸规范溶液滴定至灰色或

8、蓝紫色为终点。滴定前滴定终点同时做一试剂空白实验，记录空白滴定耗费盐酸的体积。5、计算10010010014. 0)(=%2-1FmVVc）蛋白质（0.014表示表示1.0盐酸规范滴定溶液相当氮的含量盐酸规范滴定溶液相当氮的含量F表示蛋白质系数表示蛋白质系数计算结果保管三位有效数字计算结果保管三位有效数字6、阐明及本卷须知1 试剂溶液运用无氨蒸馏水配制2消化时不要用强火，应坚持缓和沸腾，消化中不时转动凯氏烧瓶，以便冷凝酸液洗下附在瓶壁上的固体残渣，促进其消化完全。3为加速消化，常参与 硫酸钾：可提高消化体系溶液温度 硫酸铜：催化剂、消化终点指示剂、蒸馏时碱性反响指示剂硫酸钾的作用硫酸钾的作用

9、参与硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸参与硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反响温度其反响式如下：作用生成硫酸氢钾可提高反响温度其反响式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3普通纯硫酸的沸点在普通纯硫酸的沸点在340340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到度提高到4000C4000C以上，缘由主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分以上，缘由主要在于随着消化过程中硫酸不断地

10、被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 ，故沸点升高。，故沸点升高。但硫酸钾参与量不能太大，否那么消化体系温度过高，又会引起但硫酸钾参与量不能太大，否那么消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而呵斥损失：已生成的铵盐发生热分解而呵斥损失： NH4NH42SO4=NH3+(NH4)HSO42SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O硫酸铜的作用硫酸铜的作用 催化剂催化剂 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 CO2+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2

11、 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反响不断进展，待有机物被消化完后，此反响不断进展，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜褐色生成，溶液呈现不再有硫酸亚铜褐色生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。清澈的蓝绿色。 可以指示消化终点的到达可以指示消化终点的到达 下一步蒸馏时作为碱性反响的指示剂。下一步蒸馏时作为碱性反响的指示剂。4样品中假设含较多脂肪或糖，在开场消化时运用小火加热，并时时摇动；或者参与少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时留意控制热源强度。5当样品消化液不易廓清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，参与30%过氧化氢23ml后再继续加热消化。 6假设取样量较大，如干试样超越5g

12、，可按每克试样5ml的比例添加硫酸用量。 7普通消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，普通消化时间约4小时，时间延伸能够引起氨的损失。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 8蒸馏安装不能漏气9蒸馏前假设加碱量缺乏，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再添加氢氧化钠用量10硼酸吸收液的温度不应超越40，否那么对氨的吸收作用减弱，置于冷水浴中运用。11蒸馏终了后，应先将冷凝管下端提离液面,清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否那么能够呵斥吸收液倒吸。7、自动凯氏定氮仪法 在凯氏定氮法的根底上开展起来的自动凯氏定氮仪法，具有平安、高效、准确的优点。仪器：消化炉自动蒸馏安装FO

13、SS 产品线产品线化学分析仪器化学分析仪器化学分析类仪器：化学分析类仪器：Kjeltec系列定氮仪系列定氮仪FOSS 产品线产品线化学分析仪器化学分析仪器化学分析类仪器：化学分析类仪器：Tecator系列消化系列消化器器Digestion Blocks消化炉Auto 20 and Auto 8250/400ml. 和100ml. Basic 20 and Basic 8250/400ml和100mlNewAuto 40100mlLift, Exhaust Manifold and Scrubber消化炉、升降安装、排废罩和涤气安装消化炉、升降安装、排废罩和涤气安装New generation

14、of Kjeltec Systems新一代凯氏定氮仪新一代凯氏定氮仪-前所未有的智能化系统！前所未有的智能化系统！ 8200 8400半自动半自动 -到到- 全自动全自动8100 8400/8420或或8460NewKjeltecTM 8100 凯氏定氮仪自动添加稀释液和碱，自动进展蒸馏和终了蒸馏，自动进展消化管排空，操作简便。专利的SAfE*技术保证在消化管中有酸/盐结晶时的平安蒸馏。 内置的平安系统保证操作者的平安。 馏出液的温度控制系统保证分析结果准确可靠。 风箱泵准确添加试剂，保证准确性。KjeltecTM 8200 凯氏定氮仪包含KjeltecTM 8100 一切的特征，另加：自动添

15、加接纳液自动平安门可添加模块晋级到全自动凯氏定氮仪KjeltecTM 8400 全自动凯氏定氮仪包括 KjeltecTM 8200的一切特征，外加： 滴定、计算和报告。可晋级和20或60位自动进样器连用，进展无人值守的全自动化操作。局域网衔接方式可以和打印机及天平进展无妨碍衔接。彩色触摸屏。经过可选计算机数据管理软件Compass实现完全由计算机控制样品注册和报告。KjeltecTM 8420 自动进样器20位自动进样器，可包容一个20位消化管架250ml和400ml消化管都可用于系统将消化管架直接装入进样器，不需求转移消化管或消化好的样品KjeltecTM 8460 自动进样器 60位自动进

16、样器，可包容3个20位消化管架 250ml和400ml消化管都可用于系统 将消化管架直接装入进样器，不需求转移消化管或消化好的样品KjeltecTM 自动进样器可选20 & 60位进样器直接将消化管架放入，不需转移消化管或转移样品250 ml和 400 ml管都可用于系统Kjeltec 8400 自动定氮仪可以直接晋级Kjeltec 8200 也可以晋级到加进样器的分析系统Kjeltec 8420Kjeltec 8460其它厂家的不能晋级或不能直接晋级其它厂家的不能晋级或不能直接晋级衔接进样器，且需转移消化管或消化衔接进样器，且需转移消化管或消化管内的样品管内的样品仪器性能丈量范围：0

17、.1 - 200 mg N 检测时间： 30mg N 用时3.5 分钟 /200mg N 用时6.5分钟 回收率： 99.5%，1-200mg N 范围 重现性： RSD 1% 滴定器精度： 2.4ul/步试剂泵体积：0-150ml，10ml步进数据存储：单机40个批次800个数据，Compass软件无限进样器：20位/60位二蛋白质快速测定法双缩脲法 紫外分光光度法 染料结合法 水杨酸比色法 1.双缩脲法 1 1反响原理反响原理 1 1原理原理 当脲被小心地加热至当脲被小心地加热至150150160160时，可时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲也叫

18、双缩脲，反响如下：缩脲也叫双缩脲，反响如下：150 160222223H NCONH +H-N(H)-CONHH NCONHCONH +NH C 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反响称为双缩脲反响：2 2方法特点及运用范围方法特点及运用范围 由于蛋白质分子中含有肽键-CO-NH-，与双缩脲构造类似，故也能呈现此反响而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。 本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测

19、定。3 3操作方法操作方法规范曲线的制造规范曲线的制造按蛋白质含量按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg 分别称取混合均匀的规范蛋白质分别称取混合均匀的规范蛋白质8 支支50mL 纳氏比纳氏比色管中色管中各参与各参与1mL 四氯化碳四氯化碳用碱性硫酸铜溶液准确稀用碱性硫酸铜溶液准确稀释至释至50mL振摇振摇10min静置静置1h取上层清液离心取上层清液离心5min取离心分别后的透明液取离心分别后的透明液于比色皿中于比色皿中以蒸馏水作参比液调理仪器零点并测以蒸馏水作参比液调理仪器零点并测定各溶液的吸光度定各溶液的吸光度A560nm 波长蛋白

20、质的含量为横坐标，吸蛋白质的含量为横坐标，吸光度光度A 为纵坐标绘制规范曲为纵坐标绘制规范曲线。线。以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为规范蛋白质样品作为规范蛋白质样样品的测定样品的测定 准确称取样品适量即使得蛋白质含量在40110mg 之间于50mL纳氏比色管中，加1mL 四氯化碳，按上述步骤显色后，在一样条件下测其吸光度A。用测得的A 值在规范曲线上即可查得蛋白质毫克数，进而由此求得样品中的蛋白质含量。4 4结果计算结果计算100/100 )cmggm蛋白质（式中 c由规范曲线上查得的蛋白质质量，mg； m样质量量，g。5 5阐明及本卷须知阐明及本卷须

21、知 蛋白质的种类不同，对发色程度影响不大。 规范曲线制造完好后，无需每次再作规范曲线。 含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。 样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出后再进展测定。 当肽链中含有脯氨酸时，假设有多量糖类共存，那么显色不好，会使测定值偏低。 碱性硫酸铜溶液由0.1mol 氢氧化钾、5g 酒石酸钾钠、1.6g 硫酸铜溶于水后加水至1000mL 配成。2.2.福林福林- -酚比色法酚比色法原理原理蛋白质蛋白质( (或多肽或多肽) )分子中含有酪氨酸或色氨酸分子中含有酪氨酸或色氨酸, ,能与能与Folin-Folin-酚试剂起氧化复原反响酚试剂起氧化复原反响

22、, ,生成蓝生成蓝色化合物色化合物, ,蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比, ,可用比色法测定蛋白质浓度可用比色法测定蛋白质浓度. . 是检测可溶是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。 测定测定 汲取一定量的样品稀释液，参与试剂汲取一定量的样品稀释液，参与试剂甲，置于甲，置于2525中水浴保温中水浴保温10min10min，再参，再参与试剂乙，立刻混匀，保温与试剂乙，立刻混匀，保温30min30min，以，以介质溶液调零，测定介质溶液调零，测定A750nm A750nm 值，与蛋值，与蛋白质规范液作对照，求出样品的蛋白白质规范液作对

23、照，求出样品的蛋白质的含量。质的含量。 本法在本法在0 060mg/L 60mg/L 蛋白质范围呈良好蛋白质范围呈良好线性关系。线性关系。3.3.考马斯亮蓝染料比色法考马斯亮蓝染料比色法 原理原理 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250 250 是一种蛋白质染料，与是一种蛋白质染料，与蛋白质经过范德华引力结合，使蛋白质染蛋白质经过范德华引力结合，使蛋白质染色，在色，在620nm 620nm 处有最大吸收值，可用于蛋处有最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。此法简单而快速，适宜白质的定量测定。此法简单而快速，适宜大量样品的测定，灵敏度与福林酚法类似，大量样品的测定，灵敏度与福林酚法类似，但不受酚类、游离

24、氨基酸和小分子的影响。但不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响。 测定测定 汲取样品稀释液汲取样品稀释液2mL2mL，加染料试剂，加染料试剂2mL2mL，混，混匀，以介质溶液调零，测定匀，以介质溶液调零，测定A620nmA620nm，与蛋，与蛋白质规范溶液对照，求出样品蛋白质含量。白质规范溶液对照，求出样品蛋白质含量。 本法在本法在0 0100mg/L 100mg/L 蛋白质范围内呈良好的蛋白质范围内呈良好的线性关系。线性关系。氨基酸态氮的测定双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂、测定方法、结果计算、阐明电位滴定法：原理、试剂、仪器、测定方法、结果计算三氨基酸态氮的测定三氨基酸态氮的测定1.双指示剂甲醛

25、滴定法双指示剂甲醛滴定法原理原理 氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当参与甲醛溶液时，中性的内盐。当参与甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消逝。这基与甲醛结合，从而使其碱性消逝。这样就可以用强碱规范溶液来滴定样就可以用强碱规范溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。RCHH3N CCOR CCOHOHNH2+HCHORCCOOHHN CH2+NaOHRCH COONaNCH2 (2) 操作方法操作方法 移取含氨基酸约移取含氨

26、基酸约2030mg的样品溶的样品溶液液2份，分别置于份，分别置于250ml锥形瓶中，各加锥形瓶中，各加50ml 蒸馏水，其中蒸馏水，其中1份参与份参与3滴中性红指示滴中性红指示剂，用剂，用0.1mol/L氢氧化钠规范溶液滴定至由氢氧化钠规范溶液滴定至由红变为红变为 琥珀琥珀 色为终点；另色为终点；另1份参与份参与3滴百里滴百里酚酞指示剂及中性甲醛酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静置，摇匀，静置1分钟，用分钟，用0.1ml/L氢氧化钠规范溶液滴定至氢氧化钠规范溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录两次所耗费的碱液淡蓝色为终点。分别纪录两次所耗费的碱液ml数。数。式中 c 氢氧化钠规范溶液的浓度，mol/L; V1用中性红作指示剂滴定时耗费氢氧化钠规范溶液的体积，mL; V2用百里酚酞作指示剂滴定时耗费氢氧化钠规范溶液的