利用磁性纳米材料特异性固定化重组大肠杆菌

1、利用磁性纳米材料特异性固定化重组大肠杆菌细菌作为一种重要的生物催化剂 , 已经广泛应用于药品、药物中间体、食品 的制备、 污水和大气处理、 化工轻工产品等工业生产中。 但游离细胞在培养基或 者反应溶液中不稳定 , 不易连续使用 , 且对反应环境有较高的要求。通过固定化得到的固定化细胞可实现细胞的重复使用 , 且在生物反应器中可 获得极高浓度的菌体 , 降低使用成本。本论文以重组大肠杆菌为研究对象 , 以蛋白 质和糖的特异性结合为基础 , 研究了重组大肠杆菌在磁性纳米载体表面的固定化。论文第二章制备了一种伴刀豆凝集素 A (conA)功能化的磁性纳米载体(Fe<sub>3v/sub&

2、gt;O<sub>4v/sub>OADP-C0n 伴刀豆凝集素 A是从刀豆蛋白 中提取的蛋白质 , 能与细菌表面的甘露糖组分特异性识别。通过共沉淀的方法制备磁性 Fe<sub>3v/sub>O<sub>4v/sub>rt米粒子，为保 护四氧化三铁纳米粒子不被氧化 , 在纳米载体表面包裹一层油酸 , 得到磁性 Fe<sub>3v/sub>O<sub>4v/sub>O纳米粒子，然后利用多巴胺自聚-氧化作用对 复合载体Fe<sub>3v/sub>O<sub>4v/sub>O进

3、行表面修饰,得到表面具有大量 活性基团-醌基的载体Fevsub>3v/sub>O<sub>4v/sub>OADP用多巴胺功能 化磁性纳米粒子表面的醌基基团与伴刀豆凝集素A蛋白上的氨基基团共价结合制备固定化载体Fe<sub>3v/sub>O<sub>4v/sub>OADP-co最后利用固定化 载体表面的伴刀豆凝集素A与重组大肠杆菌表面甘露糖组分之间的特异性结合 实现重组大肠杆菌的固定化。 实验研究了各种因素对固定化的影响 ,包括温度 ,pH, 细胞浓度和固定化时间等。酶/载体1.28 mg/mg,pH 8.0,固定化时间2 h,温

4、度4 ^oC的条件 下,获得最高的固定化收率 91%。经过优化后 , 固定化细胞相比于游离细胞表现出更高的热稳定性。经 10 次循环后 , 固定化细胞仍可以保持 62%的初始活性。这些结果表明 , 通 过特异性识别糖基和糖蛋白将细胞固定在伴刀豆凝集素A 修饰的纳米颗粒上是制备稳定细胞的潜在方法。论文第三章制备了甘露糖功能化的磁性纳米载体(Fe<sub>3v/sub>O<sub>4v/sub>OADP-ma njos利用 Fe<sub>3v/sub>O<sub>4v/sub>OA纳

5、米粒子表面大量活性基团醌基与甘露 糖胺盐上氨基发生 Michael 加成和席夫碱反应成功得到Fe<sub>3v/sub>O<sub>4v/sub>OADP-ma nn载体。大肠杆菌为革兰氏阴性菌，菌毛顶端含有的FimH蛋白对甘露糖有特异性结 合作用,利用载体Fe<sub>3v/sub>O<sub>4v/sub>OADP-mann上的甘露糖组 分成功固定化重组大肠杆菌。 本章研究了细胞浓度、 固定时间 ,pH, 温度和盐浓度 等因素对固定化影响。在细胞浓度为13.5 mg/mL,固定化时间2 h,pH8.0,4 <su

6、p>o</sup>C,磷酸盐 浓度为50 mM条件下,获得最高83泅定化收率和82%勺细胞活性回收率。与游离 细胞相比,37 ^oC 下保温3 h 后固定化细胞的稳定性相比于游离细胞 提高了 1.2 倍。10次循环利用后,固定化细胞的初始活性仍保持 50%以上。最后,利用固定化 的细胞催化甘油转化生成 1,3- 二羟基丙酮。反应12 h后,固定化细胞催化生成DHA的浓度比游离细胞高2倍。本论文制 备了两种不同的磁性纳米载体 ,以糖和蛋白质结合为基础 ,利用纳米载体表面的糖或者蛋白质固定化重组大肠杆菌 ,为细胞的高效固定化提供了新的方法。研究结果表明 ,固定化后的细胞拥有更好的稳定性和重复利用性 , 在生物催 化反应中 ,