动植物基因组denovo常见问题

1、动植物基因组 de novo 常见问题 基础知识1、什么是基因组 de novo 测序答：对某一物种进行高通量测序， 利用高性能计算平台和生物信息学 方法，在不依赖于参考基因组的情况下进行组装， 从而绘制该物种的 全基因组序列图谱。2、普通基因组的定义答：单倍体，纯合二倍体或者杂合度 <%，且重复序列含量 <50%， GC 含量为 35%到 65%之间的二倍体。3、复杂基因组的定义答：杂合率，重复序列含量50%, GC含量处于异常的范围（GC 含量V 35%或者GC含量> 65%=的二倍体，多倍体。诺禾致源对二倍体复杂基因组进一步细分为微杂合基因组（%V 杂合率V %=、高杂

2、合基因组（杂合率）以及高重复基因组（重 复序列比例 >50%）。4、怎么查询基因组的大小答：查询植物基因组大小的网站：； 查询动物基因组大小的网站：。5、基因组的项目周期6、基因组承诺的组装指标答：简单基因组：contig N50>20K scaffold N50>500K复杂基因组：con tig N50>20K scaffold N50>300K样品要求1、动植物基因组测序对取样有什么要求答：植物：需要黑暗无菌条件下培养的黄化苗、组培苗，基因组样本 量500卩g1mg,越多越好。选择纯合或杂合度尽可能小的样品（杂 合度<%）。动物：应选取肌肉、血液等含脂

3、肪较少的部位取样，尽量选择同一个体取样，以减少个体差异性对后续拼接的影响。基因组样本量500卩g1mg,越多越好。样本的性别决定模式是 XY型，则尽量选择 雌性个体（XX型），如果是ZW型，则尽量选择雄性个体（ZZ型）。2、全基因组测序对 DNA 样本有什么要求答：（1）样品需求量（单次）：小片段文库，3卩g; 2Kb5Kb大 片段文库，20卩g; 10Kb20Kb大片段文库，60卩g;完成全基因 组测序样品DNA量需求约为500卩g1mg;（2）样品浓度：对于小片段文库，50ng/口 I,对于2Kb5Kb 大片段文库，150ng/口 I;对于10Kb20Kb大片段文库，150ng/ 1;（

4、3）样品纯度：OD260/280=;无蛋白质、RNA污染或肉眼可见杂质污染;（4）样品质量：基因组完整。如需建立5Kb的插入片段文库，则电泳结果，基因组DNA主带23Kb;脉冲场电泳结果，基因组DNA主带40Kb。文库构建1、基因组测序的文库构建及测序策略答：简单基因组：180bp、500bp、2K、5K 10K; PE100测序；测序深度一般为 100-150X；复杂基因组： 180bp、300bp、500bp、2K、5K、10K、20K；PE100 测序；测序深度一般为 200-300X。2、DNA Fragment文库的定义、用途及实验流程答：（1）定义：将基因组或大片段DNA随机打断成

5、v 800bp的小片 段（主要为200bp、300bp、500bp等），加上特定接头做成 DNA文 库后直接对DNA片段进行单末端（Single-End或者双末端（Paired-E nd测序，不需要克隆到细菌中，可以获得大量的DNA序列信息。（2）用途：DNA Fragment文库制备的整个过程只需2天，单末 端测序长度可达100bp,双末端为200bp。该技术测序通量高，可在 全基因组水平上最大限度的、 完整的获取基因组及多态性信息。 广泛 地应用于基因组的de novo测序、基因组重测序、BAC测序和长片段 PCR产物测序等。3）实验流程：基因组DNA随机打断1dna片殿的末端修真4将入到

6、DNA片段的3来踹在DNA片段的末錨扣上特定接咲IFCR扩壇连上接头的DNA片段1文康检测DM在cBot的成簇扩僧1上机测序J|生物信息分析3、DNA mate-pair文库的定义、用途及实验流程答：（1）定义：首先将基因组DNA随机打断到特定大小（2-20kb）; 然后经末端修复，生物素标记和环化等实验步骤后，再把环化后的DNA分子打断成400-600bp的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠将带 有生物素标记的片段捕获。这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定 接头后建成大片段文库，不需要克隆到细菌中，直接在lllumina测序仪上进行测序。通过大片段文库构建，从而获得基因组中较大跨度（2-20kb

7、）片段两端的序列。(2) 用途：DNA Mate-pair文库制备的整个过程需要5天，这种 从较大跨度两端所获得的序列对基因组 de novo项目的组装和基因组 结构变异发掘具有非常重要的作用。(3) 实验流程：基因组DNA髄机打断将定六小片段3-10吐I末端修具生物壽标记I啣化I获得来自片显两輪4fl0-600bp的DMA片段1储怖、加接头FCK扩離上接头的DNA片段I文库检测iDNA S cBot上的廉谨扩增I上机别陣I生物信鳥分析信息分析1、什么是 Read Con tig、Scaffold答：Read:测序读到的碱基序列片段，测序的最小单位;Contig：由reads通过对overla

8、p区域拼接组装成的没有 gap的序列段；Scaffold：通过pair ends信息确定出的contig排列，中间有gap。2、什么是 N50， N70， N90答：把组装出的con tigs或scaffolds从大到小排列，当其累计长度刚 刚超过全部组装序列总长度 50%时，最后一个 contig 或 scaffold 的大 小即为N50的大小，N50对评价基因测序的完整性有重要意义；N70和 N90 的计算方法与 N50 类似，只是百分数变为 70%或 90%。3、普通基因组的解决方案答：诺禾采用自主升级的 SOAPde novol进行普通基因组组装。组装流程（图 1）包括：（1）构建不同

9、长度的插入片段文库；（2）构建 de Brujin 图；（3）化简 de Brujin 图；（4）构建 contigs；（5）构建 scaffolds；（6）补 gaps；诺禾致源的技术升级包括：（1）开发了新的序列纠错模块，降低测序错误对组装的影响；(2) 在con tigs组装步骤，开发了 Step K连接模块，以混合拼接 算法连接co ntigs,从而提升原始的con tigs长度；(3) 在 scaffolds组装步骤，开发了 ctg distanee evaluation模块, 更精确地评估con tigs间的距离；同时开发了 scaf con struction模块， 以新的连接单

10、位来组装scaffold，从而提升scaffolds的连接准确率及 长度。Fragnifinl 目nd p ai r-e-d-er*d at Hjrairies with "tfarierit insert skev2-10 KbRoprosHnl: rood 空叫uace using de 日厲即“ grarphRonww erroneous conrocicn% on It%>(i)Cllp ilp*ii Remove low- (jta JRagcHv? coverage links tiny repeats(ivJMarg bubbles图1基因组de novo测序及拼

11、接组装流程经过以上几步，最终简单基因组的组装结果至少应达到co ntigN50>20K scaffold N50>300K4、复杂基因组（二倍体杂合）的解决方案答：针对复杂基因组中二倍体杂合基因组，诺禾致源开发了NOVOheter 软件，成功实现了二倍体杂合基因组组装。 与 SOAPdenovo 相比，NOVOheter软件组装二倍体杂合基因组的技术创新主要体现在 以下几个方面：（1）通过高深度测序（200-300X）将基因组上的杂合和纯合区域分 开；（2）利用reads信息和PE关系连接杂合位点，延长原始con tigs：在 杂合部分间距离较短的情况下，利用reads信息将杂合位

12、点连接起来， 若杂合部分间距离较长时，利用Pair-End关系连接杂合位点（所以需 要加入更多类型的小片段文库，以连接不同距离的杂合位点），从而 提高了 contigs 的长度，为后续组装打下基础（图 3）；hetercontigs图3基于NOVOheter软件构建con tigsa：利用深度信息区分杂合部分（覆盖度为 n）和纯合部分（覆盖度 为 2n）;b:若杂合部分的距离较短（如 60bp），则可利用reads信息将杂合 位点连接起来；c：若杂合部分的距离较长（如 400bp）,贝y利用Pair-End关系，将 杂合位点连接起来；d：得到杂合 con tigs。注：图中不同颜色的点表示杂合

13、位点。（3）分区域构建scaffolds:同样利用con tigs深度信息区分纯合con tigs 和杂合con tigs；利用Pair-E nd关系将纯合con tigs，杂合con tigs分别 组装成scaffolds；最后将相邻的纯合con tigs和杂合con tigs进行连接， 构建更长的 scaffolds。5、如何评价组装结果答：常染色体区的覆盖度： 评价基因组常染色体区的覆盖度， 可以用 BAC或者是Fosmid序列来评估；把已公布或者客户提供的 BAC或 fosmid克隆序列作为Refrenee,将拼接完成的基因组序列map回已 知的BAC或者fosmid序列上，检查拼接的序列对已知序列的覆盖度 到什么水平。基因区的覆盖度：评价基因区的覆盖度，可以用EST序列或者是 转录组序列来评估；把已公布或者客户提供的EST或转录组序列作为 query 序列 map 到拼接完成的基因组序列上, 检查拼接序列对已知序 列的覆盖度是达到什么水平。6、影响基因组组装的因素 答：基因组的重复序列和杂合度,是否污染以及基因组的倍性情况。7、基因组项目的标准生物信息分析的内容答：基因组项目的标准生物信息分析的内容如下：（1）数据处理；（2）