反相液相色谱系统峰及其形成原因

1、反相液相色谱系统峰及其形成原因1 概述在反相液相色谱中，死体积附近往往会形成一个 或一些正的或者倒的色谱峰，这些色谱峰独立于样品而存 在，可以统称这些色谱峰为系统峰。一般地，系统峰的产生 与所使用的色谱柱，流动相添加剂以及起始有机相的比例有 关。从经典色谱塔板理论出发，流动相经泵混合经由管路系 统引入到色谱柱内， 流动相内的所有组分， 均会在固 -液两相 之间分配，直到平衡。而当样品或者其他与起始流动相组成 比例不同的溶液被注入色谱柱的时候，色谱柱头部的各物质 的分配平衡被干扰，每种物质的平衡状态被干扰之后再次回 复到平衡状态的过程中，也就产生了系统峰，检测到的系统 峰的种类与多少和采用的检测

2、器的种类有关 （如一些盐离子 在紫外检测器上无法被检测到，却可以被 CAD 检测器检测 到）。如下图1所示，流动相为 ACN : Water=4: 96,添加剂 TFA 的浓度为 0.1 % ，进样溶剂组成为 ACN ： Water=4.4 ： 95.6， 添加剂 TFA 的浓度为 0.1%。图中的正负色谱峰即为典型的 系统峰。2 反相液相色谱系统峰的影响因素如前所述，反相色谱系统 中，系统峰的形成与色谱柱，流动相的组成特别是添加剂的 种类以及浓度有关，此外配置样品的溶剂的组成也是十分重 要的因素。如下图 2A 所示，流动相的组成为乙腈与纯水， 添加剂为 1：1的 1,5-二氯蒽醌与 1,8-

3、二氯蒽醌，进样溶液为 与流动相比例相同的乙腈与纯水；图 2B 所示，流动相的组 成为乙腈与纯水，进样溶液为 1：1的 1,5-二氯蒽醌与 1,8- 二氯蒽醌溶液。由上图 2A 与图 2B ，1,5-二氯蒽醌与 1,8-二氯蒽醌在两张色 谱图中互为镜像， 此外区别还在与图 2A 与图 2B 中的两个色 谱峰的峰面积的绝对值的差异。上述现象，亦可说明反相液 相色谱系统峰的形成与流动相的组成以及样品溶剂组成之 间具有密不可分的关联。又如下图 3所示，流动相为乙腈 -水体系， 流动相中还添加有 另外两种添加剂，浓度分别为 0.001 M ，采用等度洗脱模式。 该图可以更加直观地呈现多种添加剂存在的反相

4、液相色谱 中系统峰变化的概况。一般地，当我们对样品进行分析的时候，优先使用流动相溶 解或者稀释样品，尽可能地减少由溶剂引起的一些不良的色 谱现象 （如溶剂效应等 ），此外也能够减小进样操作对于色谱 平衡状态的干扰程度。但在医药工艺以及药物分析过程中， 医药中间体以及终产品多含有酸 /碱官能团， 为了获得优异的 色谱峰峰形，流动相中往往会添加有机酸碱添加剂甚至需要 使用不同种类、不同 pH 的缓冲盐作为添加剂。由于各种添 加剂的使用，导致流动相的组成比较复杂，且各组成成分在 色谱柱固定相以及流动相之间分配并达到平衡。为了充分减少溶剂组成与流动相的组成不同引起的诸如溶 剂效应等一系列问题，我们会尽

5、可能的使用流动相作为溶 剂，但有的时候， 待分析化合物对于酸或者碱性环境不稳定， 这时为了保证样品分析时效内的稳定性，不可避免地要使用 与流动相不同的溶剂来溶解样品。除此之外，一些难溶性的 样品，有时候会使用到 DMSO 或者 DMF 作为助溶剂，而与 此同时，我们不可能在流动相中添加这些助溶剂，这也导致 溶解样品的溶剂与流动相的组成不同的情形。 以上，我们也只是针对等度洗脱模式进行的讨论，而对于梯 度洗脱模式，流动相中的各种组成成分的分配平衡过程就要 复杂的多。因此系统峰的出现，基本不可避免，特别是使用 酸碱等具有强紫外吸收的添加剂，缓冲盐以及离子对试剂的 时候。3 反相液相色谱系统峰的个数

6、一般地来说，按照反相液相色 谱系统峰理论， 反相液相色谱流动相的组成为 N 的话， 如果 检测器允许，将可检测到 N-1 个系统峰，而系统峰的正负， 与检测手段有关。如下图所示，流动相组成为乙腈：水=4 ：96，其中添加 TFA ，浓度为 0.1%；样品为空白，其组成为乙 腈：水 =4.4：95.6，其中添加 TFA ，浓度为 0.1%。从下图中， 我们看到有四个色谱峰，依次为死体积处色谱峰，溶解氧色 谱峰，TFA与乙腈的叠加色谱峰以及添加剂TFA引起的空穴效应倒色谱峰。此外，从图中也可以看出， TFA 与乙腈的叠加色谱峰面积的 绝对值要大于添加剂 TFA 引起的空穴效应倒色谱峰面积的 绝对值

7、，其原因也显而易见，在扣除乙腈所引起的色谱峰面 积之后，二者面积的绝对值，在理论上讲，应该是一致的。 如上图实例，流动相中有水，乙腈， TFA 以及溶解氧，共四 种组分，而在色谱图上却只看到 2 个色谱峰（最后一个为空 穴效应倒色谱峰） 。这是由于 TFA 在普通的 C18 色谱柱上容 量因子较小，基本不能做到较有效的保留，引起与乙腈色谱 峰的重叠，导致实际观察到的系统色谱峰个数减少的现象。4 反相液相色谱系统峰的形成的理论解释按照色谱塔板理 论，将色谱柱等效为有限元个塔板，溶质在各塔板内均要达 到分配平衡，经过适当演化，可得到下述两个数学模型，如 下图 5。其中，mm为平衡时流动相中的溶质质

8、量，k'为溶质的容量因子，ms为平衡时固定相中的溶质质量，mtotal为总质量；上角标 t 为任一时刻，下角标 i 为任一塔板。 假设流动相的组成为乙腈与水， 其中添加 0.1%的 TFA ，使用 前经超声处理， 将上述模型做以改变， 如下图 6 所示在这里， 首先假定乙腈在很小的变化范围内的时候，其分配系数维持 常数，而 TFA 的分配系数则与乙腈的浓度呈现线性相关的关 系。按照上述模型进行计算机模拟，流动相组成为乙腈：水 =4： 96，添加剂为 0.1%的 TFA。如上图 7A 所示，红色为进样乙腈：水 =4.4： 95.6，含有 0.1%TFA 的空白溶液，蓝色为进样乙腈：水 =

9、4.4： 95.6，绿 色为乙腈： 水=4：96，添加剂为 0.1%的 TFA ；上图 7B 则为， 红色为进样乙腈： 水 =3.6：96.4，含有 0.1%TFA 的空白溶液， 蓝色为进样乙腈：水 =3.6： 96.4，绿色为乙腈：水 =4： 96， 添加剂为 0.1%的 TFA 。上图 7A 与 7B 的区别在于乙腈引起的色谱峰的正负性以及 TFA 的色谱峰及其引起的空穴效应色谱峰的先后关系。其中 图 7A 与图 4 的实际色谱状况完全一致。 此外也可直观地对上述模拟结果进行解释，如对于图7A ，进样溶液的乙腈的组成比流动相的组成要高 0.4% ，由于一定 的小范围内乙腈的分配系数近似于常

10、数，高浓度的乙腈色谱 带经色谱柱后形成正色谱峰。对于 TFA ，虽然进样溶液与流 动相中的浓度均为 0.1%，但是 TFA 的分配系数随乙腈浓度 的变化而线性改变，当高浓度的乙腈溶液被注入色谱柱之 后，由于该色谱带的乙腈浓度高， TFA 在固定相内的分配相 应减少而导致检测器处检测到正峰，在该进样色谱带之后， 乙腈的浓度得到重新恢复， 固定相中的 TFA 的分配势必得到 增加，在检测器处形成空穴效应倒峰，如果仔细比较可以发 现二者的紫外吸收光谱互为镜像。如前所述， TFA 基本不被 C18 色谱柱保留的特性， 导致出峰 位置与乙腈重合，可以使用 PFBA 作为相应的添加剂，其他 条件不变， 对系统峰进行指认 （PFBA 能够被有效保留 ），如下 图 8 所示。 P1 色谱峰为乙腈色谱峰， P2 色谱峰为 PFBA 色 谱峰，P3为溶氧色谱峰，P4为PFBA引起的空穴效应的倒 峰，且其面积的绝对值与 PFBA 色谱峰面积的绝对值相等。 以上为等度模式下，系统峰所具有的特点及其形成原因。在 梯度模式下就相对比较复杂了。与等度模式下一样，同样与 色谱柱的类型以及流动相的组成以及配样溶液的组成有很 大的关系。一般地，对于强紫外吸收的添加剂，随着梯度的 运行，早期色谱图上多会形成一个比较突出的色谱平台或