「毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选」

1、毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5 ml YPD 培养基的50ml三角瓶中，30C、2 50 300r/min培养过夜；2. 取100-5 0 0 口（W 1:100）的培养物接种至含有 50ml新鲜培养基的200mL三角摇瓶 中，2830C、250-30 0 r/m i n 培养过夜 （约 20h）,至 OD60O 达到 1.31.5;3. 将细胞培养物于4 C, 1500g离心5 mi n ,用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4 . 按步骤3离心，用2 5ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5 . 按步骤3离心，用2 -5ml,1M的冰预冷

2、山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6 .按步骤3 离心，用1 60 d的冰预冷的1mo 1的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul;备注：可将其分装为8 0。一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。 比如常见的pPIC9K的载体转GS 115 一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不 同浓度的含 G4 1 8抗性的 YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶B MGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇， 就类似BMMY的功能了。? KM71比GS 11 5生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的? 对于LOX家族

3、蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入C u 2+离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养1 8 -2 4 h ,然后取菌液以1 :1加入30%M菌甘油，-8 0 °Cul/管冻存（一般用10ug以上质粒用S alI酶切，然后直接加乙醇沉淀，7 0 %乙醇洗一遍，约20ul d dH2O重溶。转化效率一般大于 100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收 kit,回收的D NA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。乙醇沉淀主要步骤如下：1）酶切体系（8 0 ul）中2倍体积的无水乙醇加 1/1 0体积的PH5.2 NaAC,混匀？2）-20C 20 分钟沉淀？ 3 ）

4、1 3 2 0 0rpm, 2 0min,离心后弃上清4?） 7 5%乙酉I 3 0 0u 1轻轻洗，同上离心5 m in,弃上清5）3 7度烘箱至无乙醇气味（或是用 搔压的出风口吹出的暖风吹）。20）6?ul ddH2O重溶） 电击转化：8 . 将5 20 2的线性化DNA溶解在5-10科l TE溶液中，与80 d的上述步骤6 所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；9 .将电转化杯冰浴5mi n ;10 .根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；1 1.电击完毕后，马上加入1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀

5、，转至1.5ml的EP管中；（置于30度摇床低速培养1h,再涂板）12 .将菌体悬液涂布于 M D平板上，每2 0 0 6 00 pl涂布一块平板；13 .将平板置于30 c倒置培养，直至单个菌落出现（3-4天）。推荐：电压1.5kV ;电容2 5F电阻2 0 0 Qo电击时间为 4 10msec=P i chia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；2,取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5 mins,放到冰上5 mins，直接就可以 用做pc r的模板了3,将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。3.用灭菌的牙签挑取菌

6、落，在PCR管中涮一下，PCR扩增，禾I用5AOX 1和3'AOX 1引物对转化子进行 PCR复筛，同时检测基因插入（如果重组质粒以 单交换的方式整合到P ich ia pas tor i s基因组，则会扩增到两条带，一条为 2.2k b （KM7 1为3 .6k b）宿主茵AOXI基因，另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-facto r信号肽序列的片段。）Ea ch 50皿 aliq u ot of competen t Pichia c ells with3g由nearizedp1asmidD NA wi 1 ly ield 50 co 1 on i es on selecti

7、v e medium.M u t s 表型重组酵母的诱导表达实验As a g en er a l ru 1 e whe n i n ducing exp ression,neverallowculturest o be more than 10-30% of y o ur total f laskvolume.1,挑选一单菌落，置于装有5 0ml MGY、BMG或BMGY培养基的50 0 ml摇瓶中，于28 -30 C /2 5 0- 3 00 r pm 培养至 OD600 = 2 6 （-1 6 - 1 8 h）;2, 室温下1 5 0 0300 0 g离心5 m i n，收集菌体，用1 /

8、5至U 1/1 0原培养体积的 MM, BMM 或 BMMY重悬菌体（约2.55ml ）;3, 将步骤2 所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于 2 8 -30 °C/ 2 5 0 - 300 rpm的摇床上继续生长；4, 每24 h向培养基中添加1 00 %甲醇至终浓度为 0. 51.0 %;5,按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml,置于1.5 ml EP 管中，最大转速离心 23 min ，分别收集上清和菌体， 分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、2 4、48、72、96 和 1 2 0 h;6 . 对分泌表达，分离样品的上清液；

9、对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于80 ° C保存备用；7 , 可以用S DS-PAG E、Western-B lo t及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。Mu t +表型重组酵母的诱导表达实验1. 挑选一单菌落，置于装有25ml MG Y、BMG或BMGY培养基的2 50m l摇瓶中，于28-30 ° C/250-30 0 rpm培养至 OD6O0 = 2-6 （16-18 h）;2,室温下15003 000 g离心5m i n,收集菌体，用M M、BMM或BMMY重悬菌体，使 O D600 =1. 0 左右（约 1 00200ml）;3.将

10、步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30° C/250- 3 00 rpm的摇床上继续生长；4,每2 4 h向培养基中添加1 00%甲醇至终浓度为0 .51.0%;5,按时间点分别取菌液样品， 取样量为Im l,置于1. 5ml EP管中，最大转速离心23min, 分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84 和 9 6h;6 .对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮 或干冰速冻后，于-80° C保存备用；7 . 可以用SD

11、S-PAGE、Wester n-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。BMG Y和BM MY的换液方式有 2种：1. 一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4 0O0rpm室温离心5 分钟后，用B MMYfc下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。2）另一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止 4小时后，直接在酒精灯 旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。用新开启的分析纯甲

12、醇，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌T IP吸取加入摇瓶就可以了。也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。菌体是在BMM件培养的，可以不用BMMY做对照，在6 0 0nm处测OD值，培养基和P B S 光吸收都很低，P B S更方便。麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到10-12,诱导培养结束后，密度可达到1 8左右。如果用1体积白M0,在生长阶段结束后，换液时 ，加入1/10 1/2体积白MMYS行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD 600可达到40- 6 0及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取

13、浓缩培养的方式实现高密度。摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。,S Mu t +/Mu t 的筛选用Sac I,Sa 1 I or S t u I线性化插入HIS4位点的载体转化 GS15 5后,多数转化子应为 Mut+,但也有 Hi s Mut '的转化子存在(见 Invitr ogen protocol p36), Not I o r Bgl 11线性化插入 AOX I位点的载体转化 GS155后，用 MD/MM 平板可区分M ut+/Mu St 。Use the p 1 a t es c o nt a in i ng the H i s + t a

14、ans f orma n t s and scre e n f or the Mut+ and MutS ph e no type as d escrib e d below.2. U sing a st e ril e to othpick , pick one c o lony and s t reak o r patch one H i s+ tr a nsforman tin aregular patte r n on bot h an MM plate an danM D p late, m aking s ure topatcht h e MM p 1 ate firs t .3.

15、 U se a new to o thpick for eacht r a nsform ant and continueuntil1 00tr a n s form a nts have b ee n patch e d (23 p lates).4. T o different i a t eMut+ fro m MutS, make one patch forea chof the contr ols (GS11 5/His+ M u tSA 1 bumin andGS11 5 / H i s+ Mut+3 -gal) ont otheMD and M M pl a t es.5. Incu b ate t he p 1 ates at 30 for 2 days.6.