NF－κB活化及WT1、MDR1的表达在急性非淋巴细胞白血病中的临床意义

1、NFB活化及WT1、MDR1的表达在急性非淋巴细胞白血病中的临床意义【摘要】 本研究通过观察初治与难治急性非淋巴细胞白血病中NFB活性及WT1、MDR1的表达水平，探讨三者在急性非淋巴细胞白血病疗效中的作用与相互关系，为寻找新的改善难治急性非淋巴细胞白血病疗效的方法提供理论依据。急性非淋巴性白血病患者45例，其中初治组20例（A组），难治组25例（分为B、C两组）。以15例单纯缺铁性贫血患者作为对照组。采用凝胶电泳迁移分析（EMSA）法检测各组病人NFB的活化水平，用逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）法检测各组病人WT1及MDR1的表达水平。结果发现，在对照组未检测到NFB活化及WT1和 MD

2、R1表达；在初治组中NFB的活化水平、WT1和 MDR1表达水平均明显低于难治组，而在难治B、C两组中三者无明显区别；各组病人细胞中NFB活化水平与WT1及MDR1的表达水平呈正相关。结论：NFB的活化，WT1、MDR1的高表达可能是急性非淋巴细胞白血病难治的原因之一，急性非淋巴细胞白血病中NFB的活化水平与WT1、MDR1的表达呈正相关。 【关键词】 NFB；WT1；MDR1；急性非淋巴细胞白血病Clinical Significance of NFB Continual Activity and Expression of WT1 and MDR1 in Acute Nonlymphocy

3、tic Leukemia2 / 21 Abstract The study was aimed to explore the NFB continual activity and the expression of WT1 and MDR1 in acute nonlymphocytic leukemia(ANLL) patients, and to investigate if the three factors affect the curative effect of ANLL together as to provide some theoretical basis for findi

4、ng new measures to improve the curative effect of refractory ANLL. The bone marrow samples of 45 ANLL patients was collected. 45 patients including 20 primary ANLL patients (A group) and 25 refractory ANLL patients. Refractory ANLL patients were divided into 2 subgroups (B, C groups). The primary pa

5、tients who was no effect after more than two courses of treatment were taken as group B, and the patients with more than two relapses were taken as group C. At the same time , 15 patients with simple iron deficiency anemia were collected as negative control. The NFB continual activity was measured b

6、y using electrophoretic mobility shift assay（EMSA） and the expressions of WT1, MDR1 were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR). The results showed that the activity of NFB and the expressions of WT1, MDR1 were not detected in 15 samples of simply iron deficiency anemia

7、subjects. The NFB continual activity ,the expression levels of WT1 and MDR1 in the refractory group were significantly higher than that in primary group（P<0.001）. But the NFB continual activity, the expression of WT1 gene and MDR1 gene were not significantly different between group B and grou

8、p C (P>0.05). By assaying the relativity between the them the NFB continual activity and the expression of WT1 or MDR1 had positive correlation in ANLL patients. It is concluded that the NFB continual activity, the overexpression of WT1 and MDR1 may be one of the reasons causing poor curative

9、 effect in acute nonlymphocytic leukemia. The NFB continual activity and the expression of WT1, MDR1, all show positive correlation in ANLL patients. Key words NFB；WT1；MDR1； acute nonlymphocytic leukemia 近些年NFB在许多领域受到关注。研究提示，NFB的异常表达与白血病有一定的相关性，并认为NFB激活是促成白血病细胞存活的一个重要因素1。在WT1、 MDR1基因启动子内均含有NFB结合位点，因

10、而WT1、MDR1基因有可能成为NFB的下游靶基因。本研究观察急性非淋巴细胞白血病中NFB的活化水平及WT1、MDR1的表达水平； 研究NFB的活化与WT1和MDR1在急性非淋巴细胞白血病中的表达水平是否相平行，旨在探索NFB与WT1及NFB与MDR1之间的关系，以明确难治急性非淋巴细胞白血病疗效欠佳是否因为NFB活化与WT1及MDR1高表达所致，从而为寻找新的改善难治急性非淋巴细胞白血病患者疗效的方法提供理论依据。 中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)NFB活化及WT1、MDR1的表达在急性非淋巴细胞白血病中的临床意义材料和方法 研究对象 急性非淋巴性白血病

11、患者45例，其中初治组20例，难治组25例。对照组15例，均为单纯缺铁性贫血患者。所有骨髓标本均来源2004年6-12月湘雅医院门诊和住院的患者。 诊断及纳入标准 初次确诊均根据临床表现、外周血涂片、骨髓细胞形态学检查、细胞组织化学染色等综合指标，并参照FAB诊断标准进行确诊。经1个标准疗程化疗后部分或完全缓解的初治病人纳入初治组（A组）；2个标准疗程化疗无效的初治者，纳入难治B组；2次复发者纳入难治C组。单纯缺铁性贫血的诊断标准依据张之南主编的血液病诊断及疗效标准2。难治的判断标准依据邓家栋主编的临床血液学3。 试剂 EMSA试剂 BCA蛋白定量试剂盒为碧云天公司出品，EMSA试剂盒为pie

12、rce公司产品，lot number:20148。 RTPCR相关试剂 焦碳酸二乙脂（DEPC）、人淋巴细胞分离液（比重1.007±0.02）均为北京鼎国生物技术有限责任公司产品；TRIzoL、 RevertAidTM First Strand cDNA Systhesis Kit、GeneRulerTM 100 bp DNA ladder为Fermentas公司原装；TaqDNA聚合酶为 Promega公司原装；琼脂糖产自西班牙，分装；无水乙醇、氯仿、异丙醇由湘雅药剂科提供，均为国产分析纯试剂。 骨髓单个核细胞分离 无菌操作取骨髓8 ml，肝素（50 U/ml）抗凝，用等体积PBS

13、液稀释混匀，缓慢加入等体积人淋巴细胞分离液，2 000rpm, 离心15分钟，取界面层骨髓单个核细胞（MNC），用PBS液洗涤2次，在显微镜下计数，台盼蓝拒染率大于99。于同一标本中，取约2×107个细胞，-70冻存，用于提取核蛋白；另取约3×106个细胞，加TRIzoL试剂1 ml，充分混匀之后，-20冻存，用于提取RNA。 NFB活化检测 应用EMSA方法进行NFB活化检测4，主要步骤包括：核蛋白抽提和浓度测定；双链寡核甘酸探针制备：设计NFB特异结合探针， sense：5AGT TGAGGGGACTTTCCCAGGC3；antisonse：3TCA ACTCCCCTG

14、AAAGGGTCCG5；生物素进行5端标记（上海博亚）；DNA结合蛋白的凝胶电泳迁移测定（gel shift assay）。DNA/蛋白结合反应：依次加入核蛋白5 g,加水至20 l,室温下放置20分钟,加12p探针2 l,室温下放置30分钟；上样,电泳（电压120 V）， 1小时,转膜（100 V） 45秒，紫外交联10秒；生物素自显影；在图像分析处理系统上分析蛋白结合性（灰度面积值）。 WT1，MDR1表达水平检测 用RTPCR方法进行WT1，MDR1表达水平检测。主要步骤包括：细胞总RNA的提取；PCR引物设计5-7：分别设计WT1、MDR1、actin引物序列。WT1：上游引物：5GG

15、CATCTGAGACCAGT GAGAA3， 下游引物：5GACACTCAGACTTGAA AGCAGT3， 扩增产物片段481 bp；MDR1：上游引物：5 CCCATCATTGCAATAGCAGG3 ， 下游引物：5GTTCAAACTTCTGCTCCTCA3 ，扩增产物片段157 bp；actin：上游引物：5CGCTGCGCT GGTCGTCGACA3， 下游引物: 5GTCACGCAC GATTTCCCGCT3，扩增产物片段619 bp；cDNA的合成；PCR扩增：条件如下，WT1：94预变性5分钟，94变性1分钟，51退火60秒，72延伸90秒，35个循环，72延伸10分钟。MDR1

16、：94预变性5分钟，94变性30秒，55退火60秒，72延伸70秒，27个循环，72延伸10分钟；PCR产物分析：PCR产物于1.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳条带，Tanon GIS凝胶图像处理系统扫描并读取光密度值，将WT1或MDR1与actin的光密度比值作为mRNA的相对表达量。各标本重复2次，取平均值。 统计学处理 结果用均数±标准差（±SD）表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson分析法。所有数据均用SPSS 12.0统计软件处理，以P<0.05为差异有显著性标准。 结 果 急性非淋巴细

17、胞白血病中NFB的活化水平及WT1、MDR1基因的表达水平 NFB在急性非淋巴细胞白血病中的活化水平 用EMSA法检测各标本内NFB的活化水平，其中较为典型标本的检测结果如图1所示。由图1可以看出，电泳速度最快的为浓黑的标记探针自由带,标记探针与核蛋白结合后,出现深浅不一的DNA/蛋白质(NFB)结合带。结合带着色越深、灰色面积越大,则NFB的活性越高。特异性竞争结合带(NFB带)消失,表明该探针与核蛋白的结合是特异的。在对照组未见DNA/蛋白质结合带；难治组与初治组比较，前者DNA/蛋白质结合带的着色及灰色面积，明显比后者深且宽（图1,表1）。 急性非淋巴细胞白血病WT1,MDR1基因表达

18、检测结果显示：在对照组未检测到WT1,MDR1;初治组及难治组的WT1,MDR1表达水平明显增高，且在难治组明显高于初治组。而难治B、C两组间无明显差别（表2）。各组病例中较为典型标本电泳见图2，3。由图2、3可见两者也无明显不同。 讨 论 NFB作为众多基因转录的调节因子,通过与其他转录因子的协同作用,在转录水平上形成复杂的基因调控网络,产生抗凋亡、促增殖、促转移的作用。它是由Rel蛋白家族中的成员以同源或异源二聚体形式组成的一组转录因子，一般非激活状态下NFB与IkB结合存在于胞浆中，当细胞受到外界因素刺激后，IkB磷酸化并迅速降解，NFB被释放、激活。近年来研究发现,多种致癌因素和临床上

19、应用的多种细胞因子和化疗药物，可以激活NFB,激活的NFB进入胞核内与相应的kB位点相结合，激活特异靶基因的转录。 WT1基因最早发现与Wilms瘤发生、发展有关。它具有抑制肿瘤和激活基因转录的双重功能，在白血病和各种实体瘤中，它主要发挥致癌基因作用8。人的WT1启动子内含有NFB结合位点，因而WT1有可能成为NFB的下游靶基因之一。激活的NFB进入细胞核内可以与WT1启动子内的NFB结合位点结合进而调控WT1的转录1。本试验结果显示：在对照组中未检测到NFB 和WT1；初治组及难治组患者NFB活化，WT1表达明显升高；难治组中两者显著高于初治组，说明NFB 和WT1与急性非淋巴细胞白血病的发

20、病及疗效有关，提示NFB活化水平及WT1的表达水平愈高，急性非淋巴细胞白血病的预后愈差 。而且NFB的活化可能导致了WT1转录水平增高，本实验同时观察到各组病人NFB的活化水平与WT1的表达呈正相关也可解释这一点，这说明在急性非淋巴细胞白血病中NFB 的活化水平与WT1的表达水平是相平行的。 难治性急性白血病疗效差多因化疗耐药或残留白血病所致。肿瘤耐药存在很多机制，凋亡受阻是肿瘤细胞产生耐药性的主要原因之一，而NFB在肿瘤中的抗凋亡作用已被大量试验所证实9。化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，激活了NFB。Bentires等10证实，多药耐药基因(MDR1)启动区域的第1外显子包含1个纯化的NFB结

21、合序列，所以激活状态的NFB与MDR1中的NFB结合序列结合促进MDR1转录。而MDR1编码pgp表达，可以通过自身膜蛋白泵作用外排多种化疗药物，减少肿瘤药物的吸收而导致耐药11。实验结果显示，15例对照组病人均未检测到NFB及MDR1。20例初治患者中仅2例MDR1表达阳性，13例NFB活化，且活化水平明显高于对照组。初治患者中MDR1的表达说明，MDR1过度表达并不完全依赖于化疗药物的长期诱导，可能与白血病的遗传异质性有关，提示ANLL存在内在耐药，这一部分病人往往化疗效果较差。难治组中NFB的活化水平与MDR1表达水平明显增高，究其原因可能是：难治组患者本身致癌因素作用较初治组强，加之化

22、疗药物的作用，大量NFB被激活；激活状态的NFB可与MDR1启动区域NFB的结合位点结合，调控MDR1的转录，使MDR1的表达增高；化疗药物本身诱发了多药耐药，致使MDR1表达增高。激活状态的NFB可使白血病细胞凋亡受阻，而MDR1高表达导致难治急性非淋巴细胞白血病耐药。本研究中难治组患者一部分是经2次标准疗程化疗未缓解的初治者，另一部分是缓解后2次复发者。两者中NFB的活化水平与MDR1的表达水平无明显区别，提示原发耐药与继发耐药患者中NFB活化水平及MDR1表达水平无明显差异。 本研究观察到NFB的活性水平与WT1及MDR1表达水平在急性非淋巴细胞白血病中呈正相关，但NFB的活化是否直接促

23、进了WT1及MDR1的高表达还有待进一步研究。但有这种可能，即在急性非淋巴细胞白血病中NFB的活化促进了WT1和MDR1的表达，从而对白血病细胞起了一定的抗凋亡、促增殖作用，并且致肿瘤细胞耐药，而使白血病的难治。因此，NFB活化水平增高很可能是导致急性非淋巴细胞白血病难治的一个主要原因，故推想应用NFB抑制剂可能会减少WT1及MDR1的表达，从而促进白血病细胞的分化，并增敏化疗药物的抗肿瘤作用，提高化疗疗效。众多实验已验证，应用抗氧化剂如乙酰半胱氨酸(NAC),或将NFB的反义核苷酸、含B顺式结合序列的引诱物(decoy)导入白血病干细胞,均可抑制NFB的活化,增进肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性

24、,促进瘤细胞的凋亡12。这提示临床治疗中可以考虑在化疗的同时加用NFB抑制剂。【参考文献】 1段卫明，陈子兴.WT1介导的转录调控通路与白血病.中国实验血液学杂志，2002;10：366-3702张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第二版.北京:科学出版社，1998:10-153邓家栋主编.临床血液学.上海:上海科学技术出版社,2001:9884EISabban ME, Nasr R, Dbaibo G, et al. Arsenicinterferontrigge red apoptosis in HTLVtransformed cells is associated with tax dow

25、n regulation and reversal of NFB activation. Blood, 2000; 96:2849-28555Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood, 1994; 84: 3071-30796OBrien M, Kruh GD, Tew KD. The influence of coordinate overexpression of glutathione phase detoxification gene product