标准菌种确认标准操作规程

1、标准苗种确认标准操作規程 目的建立标;隹前种确认标准標作规程，以减护前种汚染和生长特性的改变，保证卖验结果的可 靠性和准确性。二 囲本规程适.用于质量技制实瞼圭所用标准緒备三彖1.1 试醱苗株大肠埃希茵(Escherichia colij CMCC(B)44102全黄色葡萄球茵(Staphylococcus aureus； CMCC(B)26003枯草芽砲杆茵(Bacillus subtilisj CMCC(B)63501勺色念珠前(Candida albicans J CMCC(F)64941黑曲霉(Aspergillus nigerj CMCC(F)98003铜绿假单胞茵(Pseudomo

2、nas aeruginosa； CMCC但)10104生砲梭茵 fClostridium sporogenesj CMCC(F)980011.1.1 标准蔺株1.1.1.1 标准前株应来自认可的国龙国外蔺种收歲机构。1.1.1.2 标准蔺株经过复活并症适宜的培养基中生长后，即为标:隹缺备蔺株。1.1.1.3 标;隹橋备前株应进行慈度和特性确认。1.1.2 工作苗株1.1.2.1 标准赭备蔺株可用于制备每两个月龙主期转种的工作蔺株。1.1.2.2 工作苗株的传代次救应严格挫制，不得超过5代(从茵种收就机构获得的标准前株为弟0代丿，以防止过度的传代增加在型变化的风晦。因此必要肘，应对工作茵栋的钝度

3、和 特性进行确认。1.2 蔺种确认式脸的主要家1.2.1 筋种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适生的方法检测苗种是否为純培养场。1.2.1.2 试醱彖 茵落形态：4特定的培养基上，将待检测培养场种粹涂布戎平板划统，适宜培养后，同一平 板上的单前落的大小、形状、颜色、质地、光举等是否相彼；对于两种或以上形态的出发筋株, 应再分别挑取单茵落划线戎种释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 镜检特征：对数生长期的培养杨革兰凤染色反应应呈现一敷性；细胞形状、大小、芙膜、芽 砲等特征应相彼。1.2.2 筋种的特性确认1.2.2.1 生化试醱：各种微生场具有各£的独特的酶糸统，因而在代

4、过程中所参与的物质分解 和合成代的庐杨也不同，这些代尹杨又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生杨化学方法 来荃岌不同的微生杨的试睑即为微生杨的生化试睑。1.3蔺种的确定方法用无茵接种环粘取培养杨，蛊相应的培养基平扱上划统分禽单个苗落，并在适.宜条件下培 养。培养后观疼是否具有典型的蔺裁形态，然后挑取单一钝茵落，进行革兰氐染色、镜检，观 疼其染色特性及苗形。再做生化试殓戎使用茵种荃岌糸统进一步鉴岌蔺种。1.3.1 大肠埃希蔺的确认1.3.1.1前隊形态1.3.1.1.1 取大肠埃希蔺新鮮培养场至營养由汤培养基中，经35°C培养1824h后，形成茵 脱，管底有粘液状沉法，培养杨有龔臭味

5、。1.3.1.1.2取上述培养杨接种于謄红亚甲莹琼脂(EMB)琼脂平坂和麦康凯琼脂平板上，35°C培 养1824h后，观疼结果。Q)赌红亚甲蓝琼脂(EMB)平妆上蔺落形态呈紫黒色、龙紫色.蓝紫色龙粉红色，蔺隊中心'呈深紫 色戎无朗显睹色中心，冈形，稍岛起.，边.缘整齐，在面光谕、谡问，常有全厲光泽。表康凯琼脂平板上茵落形态呈鮮桃红色戎微红色，茵落中心呈诛桃红色，国形，扁平，边缘 整齐，表面光滑，區问。1.3.1.2革兰染色.镜检1.3.1.2.1革兰染色Q）以接种环比取无茵水于洁净栽玻片上，取苗落形恚（Q）、）的培养场少许，制成均匀涂片， 勺然戎微温，再通过火焰23次干燥使固

6、定。 滿加结禺紫染液，染色1min,水洗。 M加碘液，嫖染1min,水冼，以滤媒吸干余水。）滿加95%乙鶴，脱色2030s,至流出液无色，水洗。滿加沙黄染液，复 1minf待干后，镜检。1.3.1.2.2染色结果应是：革兰阳性蔺呈莹紫色：革兰阴性苗呈红色。1.3.1.2.3 铳检结果应是：两端钝冈的短小直杆苗，单个戎成对，革兰阴性，无芽砲，多有按 毛，以周身換毛运动戎不运动，许多黄株有芙曲和微芙脱。1.3.1.3 生化式脍1.3.1.3.1 粽基质畑 （）:取苗落形态C®.丿的培养扬接种于蛋自联木培养基中，培 养2牛48h,沿管壁加入從基质试液数滿，轻轻搖动沈管，液面呈玫瑰红色为阳性

7、，呈试剂本色 为阴性。1.3.1.3.2甲基红试验（MJ :取苗落形恚f®,丿的培养杨接种于璘酸盐葡萄無絲水培养 基中，培养48±2h,于培养液中加入甲屋红指示液23满（约1ml培养液加指示液1满丿， 轻微搖动，立即观疼，呈鮮红色戎桶红色为阳性，呈黄色为阴性。1.3.1.3.3乙犹甲基甲尊生成沈殴rv-p；:取蔺落形态（d）,丿的培养杨摟种于确酸盐葡 萄鱒絲水培养基中，培养48±2h,于2ml培养液中加入a恭酚乙醇试液1mL混匀，冉加 40%気氧化钾试液0.4mL丸分报揺，A4h （通常在30minJ出现红色应判为阳性，无红色反 应为阴性。1.3.1.3.4 枸權

8、酸盐利用试验（C）:取蔺落形恚r®,丿的培养场搖种于枸椽馥盐培养基 斜面上，培养24天，培养基44面有茵誉生成，培养基由绿色变为蓝色肘为阳性，培养基颜色 无敌变、无茵苦生长为阴性。1.3.1.3.5 乳無发酵试验：取苗落形恚f®.丿的培养杨接种于乳掳发酵管，培养2牛48h, 观疼庐酸指示剂为酸性品红者为红色：指示剂为涣麝香草酚蓝者为黄色丿,庐毛（小例管有 毛泡，毛泡无论大小都是庐毛丿。1.3.2全黄色葡萄球蔺的确认1.3.2.1蔺落形态1.3.2.1.1取全黄色葡萄球苗新鮮培养场至營养由汤培养基中，经35°C培养1824h后，呈 均匀译滋生长，繁琐轶多肘易庐生沉法

9、，沉淀易菠韬散。1.3.2.1.2 取上述.培养杨划统接种于甘疙醇気化钠琼脂平板和卵黄氮化钠琼脂平板上培养 2427h观疼结果。 甘彖尊氣化钠琼脂平板上前隊形态金黄色，圖形&起，边缘整齐，外闵有黄色环，蔺落直径0.7-1mmo 卵黄氣化钠琼脂平核上茵落形态全黄色，圏形&起，边缘整齐，外團有卵璘脂分解 的乳滋圈，茵落直後12mm。1.3.2.2革兰染色.镜检1.3.2.2.1革兰染色（见大肠埃希蔺检姿法5312丿1.3.2.2.2 铳检结果：为罩兰阳性球茵，茵体呈球形戎略呈桶圖形，苗体较小，茵体大小不一。 无芽砲，一般不庐生芙膜。排刃呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双戎短链状排列

10、。1.3.2.3 生化式脍1.3.2.3.1 血浆凝固酶试验试管比：取无前渕管（10mmXl0mmj 2支，各加入血浆和0.9%无蔺甌化钠徐液（1： 1J 0.5ml, 1支加入營养由汤培养液0.5mI作为阳性对照：另一支加入无前管养内场0.5ml作为 阴性对照。两管同肘置37“C水浴或恒温培养俞，3h后开始检冬，以后每隔适当肘间观疼一次， 直至24h。松杳肘，轻轻将试管倾斜（动作勿大丿,仔细观疼。Q）阳性对照管：血泵和无茵水混合液加全黄色葡萄球茵營养由汤培养杨，在3h后开始观疼直 至24ho结果：血象我固。阴性对照管：血漿和无前水混合液加种释液，在3h后开始观疼直至24h。结果：血象浇动 t

11、如。1.3.3 枯草芽砲杆苗的确认1.3.3.1蔺落形态1.3.3.1.1 取枯草芽胞杆蔺新鮮培养场至營养内汤培养基中，经35°C培养1824h后，呈谭 竝生长。1.3.3.1.2 取上述培养场划统接种于營养琼脂平核上，培养2427h观疼结果：前隊为次色、 干燥、皱编、无典型卷发状。1.3.3.2革兰染色、铳检1.3.3.2.1革兰染色（见大肠埃希苗检姿出5312丿1.3.3.2.2 铳检结果：罩兰阳性芽砲杆茵芽砲为桶圖到栓状，住於苗体中央龙稍偏，芽砲形成 后茵体不膨大。1.3.4 自色念珠蔺的确认1.3.4.1苗隊形态1.3.4.1.1 取自色念珠蔺新鮮培养场至沙氏葡萄穗由汤培养基

12、中，经35°C培养2448h后， 呈译滋生长。1.3.4.1.2 取上述培养扬划统接种于沙氏葡萄競凉脂培养基平板上，经3035°C培养2448h （必要肘延长至72小肘丿观疼结果：呈乳自色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母宅味，培养肘间稍久则茵落增大，颜色变深、质地变硬戎有皱摺。1.3.4.1.3 取上述5.3.4.1.2J培养场接种至勺色念珠茵显色培养基平扱上，经3035°C培 养2448h （必要肘延长至72小肘丿观疼结果：平扱上为绿色或翠绿色的筋隊生长。1.3.4.2革兰染色、铳检凤芽管试验取上述.（5.3.4.1.3J培养扬接种至慨聚山衆帝80玉耒琼脂培养基上，

13、培养2448h。取培养杨进行染色，镜检及芽管试绘。1.3.4.2.1革兰染色（见大肠埃希蔺检姿法5.3.1.2J1.3.4.2.2 芽管试脍：桃取1%聚山杂酯80玉耒琼脂培养基上的培养杨，搖种于加有一满血请 的栽玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿，置3537°C培养13h,置显截铳下观疼，可见到 由砲子长出短小芽管。1.3.4.2.3 铳检结果：革兰.阳性芽砲杆苗芽砲为厚朕砲子、蔺丝、芽管。1.3.5黑曲窑苗的确认1.3.5.1铳检：可見砲子，苗丝。1.3.6銅绿假单胞苗的确认1.3.6.1 取铜绿假单胞蔺新鮮培养扬至營养由场培养基中，经35°C培养1824h后，液面可 形成

14、茵朕，细茵在深层发育不良，呈微谭滋戎透.朗状，茵液上层为蓝绿色。1.3.6.1.1 取上述培养场接种于決化十并烷基三甲腰琼脂培养基的平妆上，培养1824h后， 观疼结果：呈扁平、无岌形、周边犷散、表面谡湘，灰自色，周国肘有蓝绿色素扩散。1.3.6.2革兰染色、镜检1.3.6.2.1 革兰染色（见大肠埃希蔺检姿法5312丿1.3.6.2.2 铳检结果：铜绿假单胞蔺为革兰阴性、无芽砲杆蔺。单个，成对戎成短链排列。1.3.6.3 氧化酶式殴取洁净德绒片置于平皿，用无苗玻癘棒取斜面培养场涂于淒纸片上，滿加新配制的1%二盐酸二甲基对笨二胺战液，在30秒若培养炀呈粉红色并逐漸变为紫红色为氧化酶试验阳性，

15、否则为阴性。若斜面培养杨为非革兰阴性无芽砲杆茵戎氧化酶试绘阴性，均判供沈品未检出鋼绿假单砲 茵。否则，应进行绿侬茵素试睑。1.3.6.4绿侬茵素(Pyocyanin)试脸取斜面培养扬接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小肘，加三気甲烷35ml至培养管 中，攪碎培养基并充分报揺。静置片刻，将三氣甲烧相移至另 7 管中，加入1mol/L盐酸沈 液约1mL报揺后，錚置片刻，观疼。若盐酸溶液呈粉红色，为绿侬筋素式醱阳性，否则为阴 性。同肘用未接种的PDF琼脂培养基斜面同法做阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。若上述紀似茵为革兰阴性杆茵、氧化酶试验阳性及绿侬蔺素试验阳性，判新供沈品检出鋼 绿假单胞茵。上述

16、.疑妆茵为罩兰阴性杆茵.氧化酶加脸阳性及绿侬茵素洪脸阴性，应继续进行 适宜的荃龙试验，确认是否为铜绿假单胞前。1.3.7 生砲梭蔺的确认1.3.7.1 取生砲梭蔺新鮮培养场2份，其中1份置80°C保温10分钟后迅速冷却。上述.2份供 试液直接后处理后分别接种至100ml的梭蔺增蔺培养基中。置庆氧条件下培养48小肘。取上 述毎一培养0.2ml,分别涂抹棲种于含庆丸零素的哥他比亚琼脂培养基平板上，置戻氧条件 下培养4&72小肘。若平板上有茵隊生长，应选2-3个茵落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试 睑。1.3.7.2革兰染色(見大肠埃希蔺检在法5.3.1.2J1.3.7.3 过氧化氢酶试验取上述平扱上的蔺落，置洁净玻片上，滿加3% it氧化飢沈液，若苗隊表面有毛泡尹生， 为过氧化飢酶试绘阳性，否则为阴性。若上述.可融茵落为革兰阳性梭茵，有或无即圆形或球形的芽砲，过氧化氮酶沈脸阴性，判 浙供 g 检出梭前，否则判供试未检出梭前。1.3.8 诲血性链球前的确认1.3.8.1 把冻干前种管、天茵滿管、培养皿、營养由汤培养基，移入微生杨卖验宝的超净工作 台上，待用。1.3.62 将冻干前种管外壁用礁酒擦冼谄秦，稍干，用75%乙尊神擦净，敖淮.天蔺培养皿，待 千。在无前条件