生物化学 第7章蛋白质理化性质及其分离纯化ppt课件

1、第第7 7章章 蛋白质的蛋白质的理化性质理化性质及其分别纯化及其分别纯化一、蛋白质的两性解离与等电点一、蛋白质的两性解离与等电点 等电点等电点pI：在某一：在某一pH值溶液中，蛋白质酸值溶液中，蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当，蛋白质分性基团和碱性基团的解离程度相当，蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液子所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的的pH值称为蛋白质的等电点值称为蛋白质的等电点(pI)。 溶液溶液pHpI时，蛋白质所带正、负电荷相等；时，蛋白质所带正、负电荷相等； 溶液溶液pHpI时，蛋白质带净负电荷；时，蛋白质带净负电荷； 溶液溶液pHpI时，蛋白质带净正电荷。

2、时，蛋白质带净正电荷。pH=pI 净电荷净电荷=0 pH pI净电荷净电荷为负为负PrCOOHNH3+ + H+ OH- + H+ OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+蛋白质是两性电解质。在溶液中的带蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电情况主要取决于溶液的电情况主要取决于溶液的pHpH值。值。v蛋白质等电点的大小与其氨基酸组成有关。蛋白质等电点的大小与其氨基酸组成有关。v对于变性的蛋白质，可由其酸性氨基酸与对于变性的蛋白质，可由其酸性氨基酸与碱性氨基酸的比例来判别。碱性氨基酸的比例来判别。v对于天然蛋白质，由于其对于天然蛋白质，由于其R R基团不能完全基团不能完全暴露在外，故不易判别。暴

3、露在外，故不易判别。v蛋白质的等电点不是一个恒定值，它受溶蛋白质的等电点不是一个恒定值，它受溶液的离子种类和离子强度的影响。液的离子种类和离子强度的影响。v蛋白质在纯水中的带电形状不受其它离子蛋白质在纯水中的带电形状不受其它离子的干扰，完全由的干扰，完全由H+的解离和结合来决议，的解离和结合来决议，这种条件下的等电点称为蛋白质的等离子这种条件下的等电点称为蛋白质的等离子点。点。v蛋白质的等离子点是特性常数。蛋白质的等离子点是特性常数。v根据蛋白质电离性质，可利用电泳的实根据蛋白质电离性质，可利用电泳的实验方法，将蛋白质进展分别、纯化和鉴验方法，将蛋白质进展分别、纯化和鉴定。定。v电泳电泳ele

4、ctrophosesis)v 带电粒子在电场中向电性相反的带电粒子在电场中向电性相反的电极挪动的景象。电极挪动的景象。v蛋白质在等电点蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳条件下，不发生电泳景象。景象。P307电泳电泳electrophosesis)二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质v真溶液的溶质分子的颗粒大小真溶液的溶质分子的颗粒大小1nm；v胶体溶液中溶质分子的颗粒大小在胶体溶液中溶质分子的颗粒大小在1-100nm；v蛋白质分子的相对分子量在蛋白质分子的相对分子量在1-100万，其颗粒大万，其颗粒大小小(2-20nm)属于胶体粒子的范围。属于胶体粒子的范围。v另外，蛋白质分子外表有许多

5、极性基团，亲水性另外，蛋白质分子外表有许多极性基团，亲水性极强，容易与水构成稳定的亲水胶体溶液。极强，容易与水构成稳定的亲水胶体溶液。蛋白质颗粒的外表电荷和水化膜蛋白质颗粒的外表电荷和水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用v蛋白质构成稳定的亲水胶体的缘由：蛋白质构成稳定的亲水胶体的缘由：v 外表构成水化层外表构成水化层v 外表同种电荷的斥力外表同种电荷的斥力v蛋白质

6、胶体溶液具有普通胶体溶液的性蛋白质胶体溶液具有普通胶体溶液的性质质 丁达尔景象、布朗运动、半透膜不透丁达尔景象、布朗运动、半透膜不透性、吸附性、胶凝性、粘性。性、吸附性、胶凝性、粘性。蛋白质的膜分别技术蛋白质的膜分别技术 P302P302 利用蛋白质的半透膜不透性，利用蛋白质的半透膜不透性，将蛋白质中所含非蛋白小分子除去将蛋白质中所含非蛋白小分子除去 膜分别技术可分为膜分别技术可分为透析透析 超滤超滤透透 析析三、蛋白质的变性三、蛋白质的变性 P2331、变性：在某些物理或化学要素的作用下，、变性：在某些物理或化学要素的作用下，蛋白质严厉的空间构造被破坏不包括肽蛋白质严厉的空间构造被破坏不包括

7、肽键的断裂，从而引起蛋白质假设干理化键的断裂，从而引起蛋白质假设干理化性质和生物学性质的改动，称为蛋白质的性质和生物学性质的改动，称为蛋白质的变性变性(denaturation)。2 2、引起蛋白量变性的要素有：、引起蛋白量变性的要素有： 物理要素：高温、高压、紫外线、电离物理要素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等；辐射、超声波等；例如：皮肤粗糙、白内障、杀菌例如：皮肤粗糙、白内障、杀菌 化学要素：强酸、强碱、有机溶剂、重化学要素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、外表活性剂等。金属盐、外表活性剂等。例如：重金属例如：重金属与与-SH-SH生成不溶性的硫化生成不溶性的硫化物物浓乙醇、去污剂

8、浓乙醇、去污剂破坏疏水作用力破坏疏水作用力3 3、变性蛋白质的性质、变性蛋白质的性质(1)(1)理化性质的变化；理化性质的变化； 如：旋光性改动、粘度添加、光如：旋光性改动、粘度添加、光吸收性质添加、失去结晶才干、溶解吸收性质添加、失去结晶才干、溶解度下降、易发生凝聚和沉淀。度下降、易发生凝聚和沉淀。(2) (2) 生化性质的变化；生化性质的变化； 变性后的蛋白质易被酶水解。变性后的蛋白质易被酶水解。(3) (3) 生物活性丧失；生物活性丧失； 这是蛋白量变性的重要标志。这是蛋白量变性的重要标志。4、蛋白量变性的可逆性、蛋白量变性的可逆性 可逆变性：是指使蛋白量变性的条件解可逆变性：是指使蛋白

9、量变性的条件解除后，能恢复其原有性质。除后，能恢复其原有性质。不可逆变性：是指使蛋白量变性的条件不可逆变性：是指使蛋白量变性的条件解除后，仍不能恢复其原有性质。解除后，仍不能恢复其原有性质。牛牛胰胰核核糖糖核核酸酸酶酶/biochemistry/gif/5.jpg牛胰核糖核酸酶的变性与复性牛胰核糖核酸酶的变性与复性 P234 -巯基乙醇巯基乙醇 尿素尿素有活性有活性无活性无活性去除尿素去除尿素-巯基乙醇巯基乙醇 /biochemistry/gif/1.jpg 当破坏了维持蛋白质胶体稳定的水化膜和外表当破坏了维持蛋白质胶体稳定的水化膜和外表电荷

10、，蛋白质胶体失去稳定性，从溶液中析出，这电荷，蛋白质胶体失去稳定性，从溶液中析出，这种景象称为蛋白质的沉淀种景象称为蛋白质的沉淀precipitation。 四、蛋白质的沉淀四、蛋白质的沉淀运用运用:1蛋白质分别纯化蛋白质分别纯化 2解毒解毒3临床检验临床检验4低温储存低温储存 P300蛋白质的沉淀可分为蛋白质的沉淀可分为不变性沉淀不变性沉淀 用于分别活性的天然蛋用于分别活性的天然蛋白质产品。白质产品。如：酶、抗体等。如：酶、抗体等。变性沉淀变性沉淀 用于生物制品中除去蛋白用于生物制品中除去蛋白质。质。v变性后的蛋白质由于变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋

11、于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性白质不一定都是变性后的蛋白质。后的蛋白质。变性不一定沉淀，沉淀也不一定变性变性不一定沉淀，沉淀也不一定变性使蛋白质沉淀的方法使蛋白质沉淀的方法 v 等电点沉淀等电点沉淀v 盐析盐析v 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀v 重金属盐沉淀重金属盐沉淀v 生物碱试剂沉淀生物碱试剂沉淀v 热变性沉淀热变性沉淀1、等电点沉淀、等电点沉淀pH=pI 净电荷净电荷=0 pH pI净电荷净电荷为负为负PrCOOHNH3+ + H+ OH- + H+ OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+2. 盐析盐析在蛋白质溶液中参与大量中性盐，以在蛋白质溶液中参与大量中性盐，以破坏蛋白质的胶

12、体性质，使蛋白质破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析从溶液中沉淀析出，称为盐析salt precipitation，salting out。缘由：盐分子与蛋白质争夺水化膜，缘由：盐分子与蛋白质争夺水化膜，并使蛋白质分子的电离抑制，外表并使蛋白质分子的电离抑制，外表电荷减少电荷减少v常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。v盐析时，溶液的盐析时，溶液的pHpH在蛋白质的等电点处效果最好。在蛋白质的等电点处效果最好。v盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。v分段盐析：分段盐析：v 半饱

13、和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量的蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的蛋白。较小的蛋白。 因此，运用不同浓度的硫因此，运用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进展酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进展初步分别。初步分别。分子量越大的蛋白质越容易盐析分子量越大的蛋白质越容易盐析v盐溶盐溶在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随着盐浓度的添加而添加，这种景象称为随着盐浓度的添加而添加，这种景象称为蛋白质的盐溶。蛋白质的盐溶。 v等电点沉淀的蛋白质溶液中参与等电点沉淀的蛋白质溶液中参与NaCl后沉淀后沉淀

14、溶解溶解盐溶盐溶b.盐溶盐溶盐析盐析蛋白质分子之间在非等电点时具有静电相互作用，蛋白质分子之间在非等电点时具有静电相互作用，盐离子破坏这些力，使分子散开，溶于水盐离子破坏这些力，使分子散开，溶于水盐溶盐溶盐析v向蛋白质溶液中参与大量硫酸铵后蛋白质会向蛋白质溶液中参与大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出沉淀析出蛋白质分子外表的疏水区域，聚集了许多水分子，高盐浓度使水化层被破坏，暴显露的疏水区域，它们发生相互作用而沉淀盐析盐析NH42SO43. 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀凡能与水以恣意比例混合的有机溶剂，如凡能与水以恣意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀

15、蛋白质。白质。沉淀原理是：沉淀原理是： 脱水作用；脱水作用； 使水的介电使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。常数降低，蛋白质溶解度降低。缺陷：常会使蛋白量变性缺陷：常会使蛋白量变性操作本卷须知操作本卷须知: 必需在低温下尽量缩短处置的时间必需在低温下尽量缩短处置的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去5 5、生物碱试剂沉淀法、生物碱试剂沉淀法原理：假设溶液原理：假设溶液pHpH小于蛋白质的小于蛋白质的pIpI，蛋，蛋白质呈正离子，可与生物碱试剂白质呈正离子，可与生物碱试剂( (如鞣如鞣酸、苦味酸、钨酸等酸、苦味酸、钨酸等) )结合生成不溶性结合生成不溶性的盐而

16、沉淀。的盐而沉淀。缺陷缺陷: :常引起蛋白量变性常引起蛋白量变性本卷须知：反响溶液的本卷须知：反响溶液的pHpIpHpI，确保蛋，确保蛋白质以阳离子方式存在白质以阳离子方式存在p3.iecool/show/161/11901.htm6、加热沉淀法、加热沉淀法凝固凝固加热使蛋白量变性并凝聚成块状称为凝加热使蛋白量变性并凝聚成块状称为凝固固coagulation。变性不一定凝固变性不一定凝固凝固一定变性凝固一定变性习习 题题1、为获得不变性的蛋白质，常用的方法是、为获得不变性的蛋白质，常用的方法是 A、用三氯醋酸沉淀、用三氯醋酸沉淀 B、用苦味酸沉淀、用苦味酸沉淀 C、用重金属盐沉淀、用重金属盐沉

17、淀 D、低温盐析、低温盐析 E、常温醇沉淀、常温醇沉淀 2、对于蛋白质的溶解度，以下表达中哪一条是错误的？、对于蛋白质的溶解度，以下表达中哪一条是错误的？ A、可因参与中性盐而增高、可因参与中性盐而增高 B、在等电点时最大、在等电点时最大 C、可因参与中性盐降低、可因参与中性盐降低 D、可因向水溶液中参与酒精而降低、可因向水溶液中参与酒精而降低 E、可因向水溶液中参与丙酮降低、可因向水溶液中参与丙酮降低3、蛋白量变性时不应出现的变化是：、蛋白量变性时不应出现的变化是： A、蛋白质的溶解度降低、蛋白质的溶解度降低 B、失去原有的生理功能、失去原有的生理功能 C、蛋白的天然构象破坏、蛋白的天然构象

18、破坏 D、蛋白质分子中各种次级键被破坏、蛋白质分子中各种次级键被破坏 E、蛋白质分子个别肽键被破坏、蛋白质分子个别肽键被破坏 4、以下哪种说法是正确的、以下哪种说法是正确的? A、蛋白质沉淀时经常导致变性、蛋白质沉淀时经常导致变性 B、蛋白质加热至、蛋白质加热至60必定变性必定变性 C、蛋白质凝固时一定变性、蛋白质凝固时一定变性 D、蛋白质在变性时溶解度经常降低、蛋白质在变性时溶解度经常降低 DBEC五、蛋白质的颜色反响五、蛋白质的颜色反响1.双缩脲反响：双缩脲反响：两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物红色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反响，肽键特征反响生同样的反响，肽键特征反响肽键的反响，肽键越多颜色越深肽键的反响，肽键越多颜色越深受蛋白质特异性影响小受蛋白质特异性影响小蛋白质定性定量测定；测定蛋白质水解程蛋白质定性定量测定；测定蛋白质水解程度度判别：由两个氨基酸组成的二肽也可以发生双缩脲反响判别：由两个氨基酸组成的二肽也可以发生双缩脲反响双缩脲反响双缩脲反响 蛋白质在碱性溶液中与蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜发生反响，产生红硫酸铜发生反响，产生红紫色络合物紫色络合物红紫色络合物红紫色络合物(碱性溶液碱性溶液)Cu2+