非放射性标记物brdu

1、浅谈溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine ,brdu）是dna前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入s期细胞单链 dna核苷酸序列替代胸腺嘧啶。brdu与胸腺嘧啶竞争掺入的强度可能与细胞增殖异常有关，如肝癌细胞约11.6%的胸腺嘧啶被替代，而正常肝细胞仅有1.1%1。既往在分子遗传学等研究中常采用同位素标记，但有放射污染，技术难度大，实验周期长等缺点。近年来非放射性标记物的研究发展迅速，然而其敏感性多数不及同位素，使实验应用受限。自82年gratzer制备出抗brdu单抗及标记检测技术不断改良提高，应用brdu标记的敏感性已与氘胸腺嘧啶核苷（3h-tdr）相似2，3。目前认为br

2、du是最有希望取代同位素的非放射性标记物之一。本文综述近年来brdu研究概况，重点介绍标记过程中有关技术问题。 一、标记技术： 1、剂量和途径： brdu可用于体内或体外标记，体内标记时，实验鼠按体重60mg-200mg/kg于鼠腹膜下注射4，5，狗按体重100mg/kg静脉注射6，人体以表面积150g/m2用量，取标本前8.25-10h静脉注射7，免疫组化检测。brdu经静脉给药一般无副作用，偶有报道过量可致细胞突变。体外标记的研究广泛而深入，通常将保存在培养液中的新鲜组织剪啐至1-2mm3大小，离心去除了上清液后，加入100g/mlbrdu，或新鲜组织在 0.3mg/ml浓度的brdu中3

3、7摄氏度1小时，然后固定包埋8，细胞标记在rpmi1640-10培养液中进行，细胞数低于1×106/ml，加入20l的brdu孵育 209。 2、标本处理： 适当的标本处理对brdu染色强度至关重要。meyer对450例乳腺癌组织体外标记总结出3点经验：（1）切组织块1mm厚；（2）固定前组织有代谢活力；（3）封闭脱氧胸腺核苷合成酶2，因此酶能使脱氧尿苷转变成脱氧胸苷，从而阻止内源性脱氧胸苷与brdu竞争掺入dna。xiang最近回顾大量文献。广泛讨论固定包埋方法后，制备狗胫骨骨折模型，设3组对照研究，结果证明70%乙醇固定，epon包埋未脱钙狗骨组织的brdu染色效果最好6。swa

4、les和smith用brdu单抗在超微水平研究昆虫血脑屏障，重点探讨标记过程对细胞超微结构特征的影响。作者比较4种固定后得出如下结论：（1）单用多聚甲醛固定可获得良好的标记效果，但细胞结构易损伤，可加入单节显性戊二醛（minomeric glut-aldehyde）联合固定；（2）等渗缓冲液加蔗糖磷酸/盐酸缓血酸胺缓冲剂或pbs对保持细胞结构有较好效果；（3）用脱氧胆酸处理可增加标记，促进抗体联接，该项研究清晰显示线粒体，高尔基体、内质网等结果器10。也有人建议如准备蛋白酶消化时，可用甲醛固定，而不用carnoy或乙醇。 3、dna变性 brdu掺入单链dna碱基序列须经酸、碱、酶或加热等打开

5、dna双螺旋结构中的氢键，离子键和碱基推积力使dna双链分离单链。dna变性方式及程度直接影响标记效果，williamson等回顾123份关于结直肠癌的报告，发现用酸变性约占80%，作者在0.05-3.00mhcl间设9个浓度比较分析，对每种浓度作用的组织切片分别数5×103个细胞，结果冰冻切片0.01m hcl浓度变性后标记指数最高。低浓度酸产生高li的原因可能dna双链失稳态，组胺蛋白离解产生易使抗原掺入的sssna片段，另有人提出用低浓度酸从dna离解出组胺蛋白后加热变性，可避免组胺产生稳定dna低抗热变性的作用。消除组胺可降低原位dna的熔解温度阈，酸预处理使染色质核小体结构

6、几乎全部破坏，从而使dna解螺旋更广泛11。坚持热变性者认为加热较酸对brdu掺入能提供更多结合部位。此外，变性和单抗孵育须严格衔接，如变性后bu20a单抗孵育延误1小时，brdu阳性细胞核标记数便从6.6%降至1.4%7，说明影响li的因素复杂，加单抗前仔细研究变性技术及干扰因素，从而获得brdu标记应有的高li是必要的。另外采作brdu标记核酸分子可能对dna变性有特殊要求，需进一步探索。 4、标记染色： 如何延长brdu作用时间以标记新进入s期的细胞。使增殖缓慢的细胞标记率提高，是另一个重要问题，早年有人用恒定套管装置和非生物降解弹丸对大鼠研究，但结果重复性差。近来maysinger研制

7、一种具有很好的生物相容性可降解的微囊用于体内、外标记，通过电镜、影像技术及免疫细胞化学分析，证明微囊中brdu能有效掺入鼠脑疾患周围的增生细胞核中，可连续释放高浓度brdu达48-50小时12。另有人研究渗透性微囊和缓弹丸，发现标记效果均优于单次注射。 研究非放射性标记物常与放射性标记物相比，以证明特异性，敏感性及其它有关特性，在同一靶细胞比较似乎更具有说服力。然而3h-t d r和brdu的比标记研究不能在同一时间给药，因两种标记物在同一个细胞增殖周期内竞争胸腺嘧啶激酶。有人认为两种标记先后给药均可，另有主张先标brdu，理由是3h-tdr放射自显影乳胶用胰酶去除时偶有细胞丢失，致其后brd

8、u标记信号损失，lin等强调brdu标记时间较3h-tdr长约50分钟，如先标记3h-tdr可望brdu能标记更多早期s期细胞3。thoolen从另外角度观察两种标记染色之间关系，将成年的雄鼠分3组，腹膜下分别注射3h-tdr，brdu和两中标记物曲小时后取睾丸标记处理，免疫金银法染色，分别计数精原细胞每组平均阳性胞核数量，结果3h-tdr标记为162个，brdu标记为166个，双标记为146个说明90% brdu掺入的清原细胞显示3htd r标记，另有10%胞核仅显示一种标记，无交叉性。3h-tdr的射线散射范围有限，使放射自显影反应不可能超过远离乳胶1m以上的胞核，这些胞核或许能被brdu

9、标记显色，少数细胞仅接受一种标记的确切原因不清楚，也可能与碱基配对所形成的氢键数量有关。此外已证明微波，氯化锂13、氟尿嘧啶核苷等均有助于brdu标记。 二、检测： brdu特异掺入s期细胞，通常测定其li，即s期细胞占细胞周期的百分数，标记阳性为光镜下致密覆盖于胞核上的褐色沉淀物。检测方法用单抗或多抗的免疫化学法，也可用dna荧光染料染色的细胞化学法。目前常用免疫金银法，因该法不受内源性过氧化酶影响，较免疫酶标法有更好对照背景。不同类型细胞dna对变性敏感性的差别可能由染色质结构决定，某些类型对变性反应迟钝，使检测不敏感或失败，有人提倡单抗联接brdu后用fcm检测较免疫组化法更客观省时，且

10、可测出肿瘤倍体14。但需注意恶性瘤常伴组织及细胞坏死，brdu不能掺入死亡细胞，故用fcm分析须除外死亡细胞，否则可被错误当成静止细胞。胰酶和dnase混合孵育细胞标本有可能克服死亡细胞干扰 三、brdu标记和3h-t d r标记的比较 与32p、35s等常用放射性核素相比，3h-tdr释放的-粒子能量低，散射极少，因此感光乳胶上的成影分辨最高，放射性损伤相对较小，且半衰期较长。3h-tdr标记用放射自显影术和闪烁计数检测，灵敏度高，结果确切。其应用价值已经肯定。因此研究非放射性标记物多以3h-tdr为标准对照。在肿瘤生物学和细胞增殖动力学的研究中，mayer在试管内分析一组人乳腺癌大样本，比

11、较brdu和3h-tdr的标记效果，3h-tdr标记234例，平均li为6.9±0.4%；brdu标记450例，平均li6.4±0.3%，两种标记物无显著差异(p0.05)。brdu和3h-tdr标记的肿瘤大小，组织类型，淋巴结转移，胞核大小以及dna倍体均正相关，充分说明两种标记物之间的密切关系。在同一靶细胞标记也证明90%以上标记3h-tdr阳性细胞也标记有brdu，反之亦然。 四、应用： brdu标记用于dna修复、复制、分子杂交的重组dna技术可替代同位素标记，在分子生物学、遗传学、细胞增殖动力学，肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力等领域有广泛应用价值。kitaza

12、ws等用brdu标记对白血病细胞hl-60和k562基因表达进行研究，将标记dna和rna原位杂交，发现80%用于合成dna的胸腺嘧啶被brdu替代15。stevenson等用brdu单抗和fcm对哺乳动物细胞balb/c，3t3，colon26等6种细胞系研究杀瘤性巨噬细胞的细胞毒作用对细胞动力学的影响。受试细胞系接触m之前，先经brdu脉冲标记，即在适当时间加入b rdu，只作用短时间马上洗去，以保证brdu掺入dna的精确时间，结果发现在12小时的细胞培养中，6促细胞系的细胞均可被杀瘤性m阻滞在细胞周期的每一个时相内16。 近几年来，由于brdu标记方法敏感、简单和迅速，该技术在肿瘤增殖

13、动力学领域的研究也非常活跃17-20。目前brdu标记不仅用于肿瘤诊断，评估预后，对指导肿瘤治疗已受重视，将活检标本li作为术后的是否行辅助治疗的依据，尤其对增大的区域淋巴结价值更大，区域淋巴结已转移病例可按li高低确定化疗方案，现已明确小剂量化疗后肿瘤复发者是li高的病例，而不是li低者。值得提出的是brdu的li较fcm的di更客观可靠，因fcm难于识别双相二倍体和异倍体肿瘤dna分布的s期细胞，而且di的s期细胞数也可能含有死亡细胞21。此外已证明brdu替代腺嘧啶所合成的dna对放射性物质更敏感，使肿瘤对放疗的敏感性增加22，23。可以预言，brdu标记作为一种新近倍受重视的材料和方法

14、在生物医学领域的应用前景将会十分广阔。    参考文献 knol ja .walker sc ,roberison jm ,et al.incorporation of 5-bromo-2deoxyuridine into colorectal liver metastases and liver in patients receiving a 7-day hepatic arterial infusion .cancer res ,1995,55:3687  meyer js .koehm sl, hughes jm et al.bromodeoxy-uridi

15、ne labdling for s-phase measurement in breast carcionma .cancer,1993,71:3531  lin p ,allison dc .measurement of dna comtent and of tritated thymidine and bromodeoxyuridine incorporation by the same cels .j histochem cytochem 1993,41:1435  thoolen b .brdurd labeling of s-phase cell in teste

16、s and small intestine of mice ,using microwave irradiation for immunogold silver staning an immuncoytochemical study ,j histochem cytochem 1990,38:267  pollack a .terry nha ,wu cs et al. specific staing of iododeoxyuridine and bromodeoxyuridine in tumors donble labelled in vivo;a cell analysis

17、cytometry  1995,20:53  xiang z .markel md .bromodeoxyuridine immunohistochemistry of eponembeded undecalcified bone in a canine fracture healing model.j histochem cytochem 1995,43:629  williamson k ,gilliland r ,weir h ,et al.hydrochloric acid denatuarion of colorectal tumour tissme i

18、nfiltrated with bromodeoxyuridine cytometry ,1994,15:162  situdetection of histone mrna in the assessment of epidermal proliferation comparison with the ki67 antigen an brdu incorporation ,brit j derma,1995,132:359  li x ,traganos f .melamed mr et al.single step procedure for labdling dna

19、strand breake with flo  uoresceunor bodipy conjugated deoxynucle otides detection of apoptosis and bromodeoxyuridinne incorporation cytometry ,1995,20:172  swales ls ,smith pjs .immunohistochemical localisation of the thymidine analogue 5-bromo-2-deoxyuridine in insect tissue preservarion

20、of cellular ultrastructure .tissue & cell .1990,22:331  moran r .darzynkiewicz z ,staiano coicoil ,et al .detection of 5-bromodeoxyuridine incorporation by monoclonal antibodies role of the dna denaturation step j histochem cytochem ,1985,33:821  maysinger d .filipovic grcic j ,alebic

21、kolbah t ,preparation characterization  and release of microencapsulated buomodeoxyuridine life scien 1994,54:27  saxe a .gibson g .effect of lithium on incorporation of bromodeoxyr ridine and tritated thymidine into human parathyroid cells.arch surg ,1993,128:865  ritter ma .new appr

22、oaches to cell kinetics in human tumors .current prob cancer ,1993,17:343  kitazawa s takenaka a .abe n et al .in situ dna-rna hybridization using in vivo bromodeoxyuridine labeled dna probe .histochemistry,1989.92:195  stevenson ap .crissman ha ,stewart cc mactophageinduced cytostasis kin

23、etic analysis of bromodeoxyuridine pulsed cells !cytometry1985,6:578  nylander k anneroth g ,gustafsson h et al.cell kinetics of head and neck squamous cell carcinomas acta oncologica,1994,33:23  ritter ma .albrectson jt .kim yt .et al. tumour cell kinetics in mixed populations ,cytometry ,1994,16:118  jensen po .larsen jk .christensen ij ,et al.dis