大鼠脑出血灶周水肿变化及缺血改变探究

1、大鼠脑出血灶周水肿变化及缺血改变探究摘要目的：通过观察大鼠脑出血模型不同时段的脑含 水量，灶周缺血区，凋亡细胞指标的改变，探讨血肿灶周水 肿、缺血的变化。方法：自体动脉血注入法制作大鼠脑出血 模型，于脑出血(icit)损伤后3、5、7、14、21 d时间点 进行脑含水量测定，2, 3, 5-氯化三苯基四氮哇(ttc)染 色，原位末端标记(tunel)法检测凋亡细胞，应用图像处 理软件，结合病理组织学改变，比较各个时间点ich模型血 肿灶周水肿与缺血的演变过程。结果：ttc染色，血肿周围 色淡染，梗死带内径逐渐扩大，14 d后变化最为显著3 d 组(0.31±0.06) mm； 14

2、d 组(2. 03±0. 13) mm (p1材料与方法1. 1材料1. 1. 1实验动物sd雄性大鼠，体重200 g左右，由山 西医科大学动物实验中心提供。1. 1. 2试剂2%ttc溶液、tunel试剂盒均购于山西省太 原市boster试剂公司。1. 1.3仪器立体定位仪、必要手术器械；方正v70+扫描 仪、计算机设备及软件。1.2动物模型制作大鼠术前8 h禁食，不禁水。参照deinsberger4 > 周中和等5的报道方法，采用二次注血/退针法：缓慢注射 自体血100卩1至基底节区制成大鼠ich模型；对照组相同 部位打孔进针，不注血。实验阳性大鼠选择参照bederson

3、等6的方法：神经功能缺陷评分22分，及大鼠脑切片中有 明显的圆形、椭圆形或不规则的血肿存在为模型成功标准， 血液针道反流、进入脑室或死亡者均剔除。1.3试验分组sd大鼠45只，30只造模。按起病后不同时间各分为3、 5、7、14、21 d 5个组，每组各9只（3只对照+6只模型）。1. 4脑组织he染色及ttc染色各组大鼠于ich损伤后在相应的时间点用过量的水合氯 醛麻醉，直接断头取脑，完整取出脑组织，用滤纸吸干脑组 织表面的液体和血迹，-2（rc冰箱冷冻2030 min,以进针点 所在且垂直于大脑纵裂的冠状面为中心（尽量通过血肿中 心）切分脑组织为前后两部分，向前向后取脑冠状脑片各2 片，在

4、4片脑片中取包含血肿较小者固定，石蜡包埋，用于 he染色和tunel试验；将剩余3片脑片置已预热到37*的 2%ttc溶液中，37°c恒温箱内避光染色20 min,再浸泡在4% 多聚甲醛中固定812h。扫描仪扫描标本切面（光学分辨率 和色彩位数分别设置为600 dpi, 24位真彩色）。观察灶周 染色情况；运行图像处理软件运用visual basic 6. 0,打开 扫描图像，测量梗死带内径，单位为mm；测量血肿面积，单 位为mm2。对照组同时同部位做相同处理。1. 5水肿程度评估取1.4中所述模型的剩余脑组织用电子天平先称取湿 重，电热恒温培养干燥两用箱10ctc烘烤48h,再称取

5、干重。 利用脑组织含水量二（鲜质量-干质量）/鲜质量x100%进行 计算。1.6 tunel法检测凋亡细胞标本切片常规脱蜡（不过h202）,用蒸馆水洗2次，pbs溶液洗2次，每次5 mino配制新鲜的蛋白酶k （蛋白 酶k 20 ug溶于10 mm tris/hcl中），标本片加新鲜稀释 蛋白酶k后37工烤箱中孵育20 mino20 min后，取出标 本，用pbs洗3次，每次5 mino闭光环境下加tunel反 应混合物，加完后在烤箱中孵育1 h, 1 h后pbs洗3 次，每次5 min。避光环境下加pod 37°c温箱中孵育30 min, 后pbs洗3次，每次5 minodab显色

6、：取1 ml蒸馆水， 依次加入显色试剂盒中a、b、c试剂各一滴，混匀后加至标 本片上，镜下控制显色时间310 min,水洗。苏木素复 染、脱水、透明、封片。1.7统计学处理数据以均数土标准差（x土s）表示。运用spss 17.0软 件对数据进行统计学分析，相同时间点手术组与对照组的比 较采用两样本t检验；手术组不同时间点的组间比较采用单 因素方差分析。p<0. 05表示差异有统计学意义。2结果2. 1 he染色光镜下可见出血灶与远隔正常脑组织间有一过渡带即 血肿周围区。3 d时，红细胞溶解，出血灶周炎细胞增多以 分叶核中性粒为主，水肿明显，出现少量红色的坏死神经元; 5 d时出现少量红细

7、胞溶解后的棕黄色颗粒，炎症细胞，细 胞水肿程度与3 d时相似，能看见少量坏死神经元；7 d时 依然可见水肿、炎细胞，且水肿细胞间夹杂有核固缩或碎裂 的细胞，坏死神经元细胞增加；14 d时水肿细胞明显减少， 大量坏死细胞及细胞框架，炎细胞及神经元结构不好辨认； 21 d时血肿吸收者留有中风囊，囊周细胞基本正常。血肿未 吸收者周边丧失细胞结构，色淡染，只见不全细胞结构和坏 死后的轮廓。2. 2 ttc染色正常脑片被均匀染成玫红色，灶周区域色淡染，梗死组 织呈基本规则的白色带条状，血肿呈灰黑色。梗死带结果见 表1,血肿大小变化结果见表2。注：与相同时间点对照组比较，*p本实验对于脑出血水肿高峰期后的

8、病程变化有一个较 为直观的阐述，为脑出血的治疗，特别是在脱水治疗时间方 面提供新的思路。此外，通过试验我们可以看到细胞凋亡在 脑出血后是极为重要的一个环节。因此，加大细胞凋亡在出 血性脑损伤中的作用及脑出血导致细胞凋亡的原理，利用各 种方法阻止细胞凋亡的启动和发展，有可能成为防治出血性 卒中的新途径。参考文献1 heo jh, han sw, lee sk. free radicals as triggers of brainedema formation after stroke j free radie biol med,2005,39(1):51-70.2 kimelberg hk. c

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