实验二十五基因重组实验Ⅳ——重组

1、实验二十五 基因重组实验重组体的筛选与鉴定 原理 限制性内切核酸酶酶切鉴定：具体原理见实验二十一。 PCR反响鉴定：具体原理见实验十八。 试剂 1、DNA模板 2、引物 3、Taq DNA聚合酶 4、dNTPsdATP、dGTP、dCTP、dTTP 5、10×PCR 反响缓冲液：100mmol/L Tris-HCl pH 8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，0.1%明胶 6、矿物油 1、 超纯水 8、EcoR I酶解反响液10×: 1mol/L pH7.5 Tris-HCl , 0.5mol/L NaCl , 0.1mol/L MgCl2 。

2、9、Hind III酶解反响液10×：1mol/L pH7.4 Tris-HCl , 1mol/L NaCl , 0.07mol/L MgCl2 。 3.50×TAE 电泳缓冲液：称取242克Tris，参加57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA，调节pH至8.0，加蒸馏水至1000ml。 10、.凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液w/v。 11、1%1.5%琼脂糖凝胶：1×TAE 100ml含1g1.5g琼脂糖。 器材 1、DNA扩增仪 2、电泳仪、电泳槽 3、微量移液器 4、紫外投射仪 5、0.5ml塑

3、料离心管 6、样品槽模板梳子 7、锥型瓶100ml或50ml 8、一次性塑料手套 9、凝胶成像系统 操作步骤 1. 酶切反响体系的建立20l反响体系 按下表要求配制酶切反响体系 质粒DNA 6l 10×Buffer 2l HindIII 1l H2O 10l EcoR I 1l 混匀后置37水浴3h。 2. PCR反响体系的制备（25l反响体系） 按下表要求配制酶切反响体系 DNA 2l 10×Buffer 2.5l dNTP 0.1l H2O 17.2l Primer-1 0.1l TaqE 1l Primer-2 0.1l 50%甘油 2l 混匀后，2000rpm离心3

4、0sec，然后按 94 5min 94 40sec 55 40sec 35cycles 72 90sec 72 3min 3. 电泳：1%琼脂糖凝胶酶切和1.5%琼脂糖凝胶PCR反响 将20l酶切和PCR产物进行电泳，观察结果。 Vocabulary in Biochemical technology A Absorbance 吸光度 Absorbent 吸附剂 Absorption chromatography 吸附层析 Absorption spectrum 吸收光谱 Acrylamide, Aa/Acr 丙烯酰胺单体 Adenine, A 腺嘌呤 Affinity chromatogra

5、phy 亲和层析 Agarose 琼脂糖 Agarose gel electrophoresis，AGE 琼脂糖凝胶电泳 Allele specific oligonucleotide, ASO 等位基因特异性寡核苷酸杂交 Ammonium persulfate, AP 过硫酸胺 Angle rotor 角式转头 Anion exchange chromatography 阴离子交换层析 C Carrier ampholyte 载体两性电解质 Cation exchange chromatography 阳离子交换层析 Cellulose acetate membrane electro -p

6、horesis，CAME 醋酸纤维薄膜电泳 Cellulose ion-exchangers 纤维素离子交换剂 Centrifuge 离心机 Centrifugal force 离心力 Centrifugal technique 离心技术 Coenzyme 辅酶 Column chromatography 柱层析 Cytosine, C 胞嘧啶 D Denature gradient gel eletro -phoresis , DGGE 变性梯度凝胶电泳 Deoxyribonucleic acid, DNA 脱氧核糖核酸 Dialysis 透析 Differential centrifuga

7、tion 差速离心 Discontinuous PAGE 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 E Eletro-osmosis 电渗 Emission spectrum 发射光谱 Exclusion chromatography 排阻层析 G Gel chromatography 凝胶层析 Gel filtration 凝胶过滤 Guanine，G 鸟嘌呤 H Homogenizer 匀浆器 Holozymase 全酶 I Ion-exchange chromatography 离子交换层析 Ion-exchange gel 离子交换凝胶 Ion-exchange resin 离子交换树脂 Isoele

8、ctric focusing, IEF 等电点聚焦 Isoenzyme 同工酶 L Ligand 配基 M Melting temperature, Tm 溶解温度 Matrix 载体 Mobile phase 流动相 Molecular sieve filtration 分子筛过滤 N N,N,N,N-methylenc Bisacrylamide , Bis N,N,N,N-四亚甲基 双丙烯酰胺 N,N,N,N-tetramethylethylenedi -amine, TEMED 四甲基乙二胺 O Osmosis 渗透 P Paper chromatography 纸层析 Partiti

9、on chromatography 分配层析 Partition coefficient 分配系数 Photoelectric colorimetry 光电比色法 Plasmid 质粒 Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE 聚丙烯酰胺凝胶 Polymerase chain reaction, PCR 聚合酶链反响 Primer 引物 R Relative centrifugal force, RCF 相对离心力 Restriction endonuclease ，RE 限制性内切酶 Restriction fragment length polymo

10、rphism, RFLP 限制性片段长度多态性 Rate zonal centrifugation 速率区离心法 Reverse osmosis 反向渗透 Revolution per minute ,rpm 每分钟转速 Ribonucleic acid, RNA 核糖核酸 Rotor 转头 S Salting in 盐溶 Salting out 盐析 Saphadex 葡聚糖凝胶 SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶 Sedimentation coefficient 沉降系数 Sedimentation velocity 沉降速率 Sedimentation time,ST 沉降时间 Sepharose 琼脂糖凝胶 Sequencing 测序 Single strand conformative polymorphism, SSCP 单链构象多态性 Sodium dodecyl sulfate, SDS 十二烷基硫酸钠 Spectrophotometer 分光光度计 Spectrophotometery 分光光度法 Stationary phase 固定相 Swing-out rotor 水平式转头 T Thin-layer chromatography, TLC 薄层层析 Transmittance 透光率 Thymine, T 胸