普通光学显微镜的使用及微生物制片及染色技术

1、普通光学显微镜的使用及微生物制片及染色技术实验目的：1、学习普通光学显微镜的使用方法.2、学习掌握单染色的操作技术和无菌操作技术。3、了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。4、掌握划线分离纯化微生物的原理与方法实验材料:1、器材：灭菌棉签（装在试管内），试管架，记号笔和废物缸、培养皿、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角勺、高压蒸汽灭菌锅、ph试纸、棉花、牛皮纸、麻绳、锥形瓶、洗瓶、载玻片、接种杯、 酒秸灯、擦镜纸、显微镜2、染色液和试剂：牛肉膏、蛋白豚、nacl.琼脂盐酸溶液、轼氧化钠溶 液、无菌水、结晶紫、95%酒精、蕃红、碘液3、活材料：枯草杆菌、培养24小时的

2、大肠杆菌、金黄色衞萄球菌三、实验原理：1、用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染 料的离子带止电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当 它牛长丁中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采丿ij碱性染料 如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料离子带负电荷， 能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基ph下降时，细菌所 带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料焰前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。2、简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细 菌细胞的构造

3、3、革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家c.gram所创立的。革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（gj和革兰氏阴性菌（gj两大类，是细 菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为ct菌和g菌，是由这 两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。菌的细胞樂小含有较多易被乙 醇溶解的类脂质，而口肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了 类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果 细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。g*菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度髙 ，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因 此细菌仍保留初染时的

4、颜色。4、水的沸点可随压力的增加而提窩，当高压蒸汽灭菌锅中水煮沸时，锅是密闭 的，蒸汽不能溢出，而使压力増加，水的沸点和温度也随z增加。因此，高压蒸 汽灭菌是利用高床蒸汽产生的高温，以及热蒸汽的穿透能力來达到灭菌的目的。一般在o.impa (151b/in2)的压力时,温度可达121°c只要维持1520min,就可 杀死一切微牛物的营养体和它们的各种砲子。四. 实验步骤i o微生物的分离与纯化1牛肉膏蛋白懂的制备(1) 计算 根据配方计算出实验中各种药甜所需要的量。(2) 称量 准确称取各种成分，一起放入烧杯中。(3) 溶解 向烧杯内加入所需的水量，并加热融化。(4) 调ph值 川p

5、h试纸测定其ph值，并川氢氧化钠溶液和盐酸溶液进行调节。(5) 转移灭菌 将配好的培养棊装入配有棉塞的三角瓶内。(6) 包扎 三角瓶的棉塞外用牛皮纸包扎，纸上表明培养基的名称、配制日期等。2、培养基的高压蒸汽灭菌(1) 加水于灭菌器内到规定的水平而。(2) 需灭菌的物品，培养基及包扎好的培养皿放入灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松， 太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。(3) 将灭菌锅盖的排气管插人套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。(4) 打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气约5lomin,关闭放气阀。(5) 关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽乂不断增多，

6、这吋压力和温度都 升，直至床力衣指针达到所需压力时，开始计时，通过调节热源，维持此压力到所需 时间。(6) 灭菌完毕，待压力自然降至0时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压致 使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。(7) 打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养棊。灭菌锅用完后，将锅内剩余的水倒掉, 以免日久腐蚀。3、微生物的分离与纯化 分区域用记号笔在培养皿底划出三个区域，由小到大依次标记1、2、3,留下备用 倒平板：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，左手 拿培养肌并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基，加盖后轻轻摇动使培养基均匀分

7、布在培养皿底部，然后平置于桌而上，待凝后即为平板，并用记号标明培养棊名称 划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，接种环烧完后，挑去培养皿内的菌种， 然后在标记号的培养.iiil中划线。现在一区中划，然后加热接种环，从一区中引出一条菌线， 在二区中划线，依次法在三区中划线。划线时一区较紧凑，二区较松，三区最松。 将整理好的培养皿放入恒温条件卜培养，留待观察。ii、微生物制片及染色技术及普通光学显微镜的使用1、简单染色:（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴蒸懾水，将接种环加热消毒后，等温度 变低后，取金黄色葡萄球菌涂抹到蒸懾水内。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒粘灯火焰上方文火烘干

8、。注意不要使装片温度过高。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰23次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加结晶紫染色一分钟。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注: 勿冲去菌体）。（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或川吸水纸吸干。留下备川。2、革兰氏染色:（1）涂片：取t净载玻片一块，在载玻片上加四滴蒸绸水，将接种环加热消毒后，等温度 变低肩，取金黄色葡萄球菌涂抹到蒸镭水内，然后再将接种环加热消毒后，等温度变低，取培养24小时的大肠杆菌到蒸蚀水屮，依此法再涂抹枯草杆菌以及z 前接种纯化的菌。（2）晾干：与

9、简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂而）的结晶紫 染色液染色1分钟。（5）水洗：倾去染色液，川水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌 体oo（6）媒染：滴加碘液，媒染lmin。（7）水洗：用水洗去碘液，倾去染色液，用水自玻片-端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20-25s至流出液无色，立即水洗。（9）复染:滴加蕃红复染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液，倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下 的水变无色为止（注：勿冲去菌体）

10、。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。放置好备用。3、镜检（1）取镜和放置：显微镜平吋存放在柜或箱中，用吋从柜中取出，右手紧握镜臂，左一手托 住镜座，将显微镜放在白己左肩前方的实验台上，镜座后端距桌边12寸为宜，便于坐着 操作。（2）把显微镜取出，然后接电到止确的插座（3）检杳有无脏污,有的话沾些许95 %的酒精除去脏污（4）打开并调整光源，避免灯源高度太强，使微生物检体死亡（5）放置玻片标本：取一玻片标木放在镜台上，一定使有盖玻片的一而朝上，切不可放反，用 推片器弹赞夹夹住，然后旋转推片器螺旋，将所耍观察的部位调到通光孔的止中。（6）调节焦距：以左手按逆时针方向转动粗调节

11、器，使镜台缓慢地上升至物镜距标本片约5毫 米处，应注意在上升镜台时，切勿在目镜上观察。一定要从右侧看着镜台上升，以免上升 过多，造成镜头或标本片的损坏。然后，两眼同时睁开，在目镜上观察，缓慢转动粗调节 器，使镜台缓慢下降，待物像出现后，在转动细调节轮反复微调，直到影像清晰为止 如果物象不在视野中心，可调节推片器将其调到中心（注意移动玻片的方向与视野物象移动 的方向是相反的）。如果视野内的亮度不合适，可通过调节光源亮度，如果在调节焦距时， 镜台下降已超过工作距离（5.40mm）而未见到物象，说明此次操作失败，则应重新操作， 切不可心急而有目地上升镜台。（7）转动转换器，调换上高倍镜头，转换高倍镜

12、时转动速度要慢，并从侧而进行观察（防止高 倍镜头碰撞玻片）。（8）调节焦距：转换好高倍镜后，用在h镜上观察，此时一般能见到一个不太清处的物象，可 将细调节器螺旋，可获得清晰的物彖（切勿川粗调节器!）（9）如果视野的亮度不合适，可用显微镜上的灯來调节，如杲需要更换玻片标本时，必须顺 时针（切勿转错方向）转动粗调节器使镜台下降，方对取下玻片标本。（10）在使用油镜z前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。（11）转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加-滴香柏油，然后慢 慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。（12）用观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍一高倍一油镜程序。 在加油区内重找应按：低倍一油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。（13）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二卬苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干 擦镜纸擦干净。（14）实验完毕后应将显微镜收拾干净，将接物镜转至最低倍数，关闭电源，拔掉插头，收入 保存箱或戴上防尘套4、观察时记录图像。五、实验结果及分析1、实验结果细困名称菌体颜色细菌形态结果(g+/g-)