cd4_' _cd25_' _调节性t细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究

1、中山大学博士学位论文CD4CD25调节性T细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究姓名：孙敏申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：杨培增20100521孙敏博士学位论文：C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究中文摘要C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究专业：眼科学博士研究生：孙敏导师：杨培增教授中文摘要C D 4 + C D 2 5 + 调节性T ( T r e g ) 细胞是由胸腺产生的特异性T 细胞亚群，在维持机体外周免疫耐受中发挥中重要作用，C D 4 + C D 2 5 + T r

2、 e g 细胞的缺失或者功能下调可以导致多种自身免疫性疾病的发生。C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞特异性地表达F o x p 3 ，若F o x p 3 表达缺失，自身反应性T 细胞克隆将变得活跃并导致多种严重自身免疫性疾病的发生。实验性自身免疫性葡萄膜炎( E x p e r i m e n t a lA u t o i m m u n eU v e o r e t i n i t i s 。E A U )是一种器官特异性的自身免疫性疾病，也是研究人类葡萄膜炎的一个经典动物模型。尽管E A U 与人类葡萄膜炎在病理改变上极其相似，但两者在病程上有显著的区别，E A U

3、 的炎症表现为单向性、自愈性，而人类葡萄膜炎则多表现为慢性、复发性。大量研究证明T h l 和T h l 7 两群效应性T 细胞在E A U 和人类葡萄膜炎的发病过程中起重要作用。C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞可能通过调节这两群效应性T细胞参与E A U 的发生、发展以及转归。在E A U 发病过程中，C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞的作用及其与效应性T 细胞的关系尚未见报道。本课题旨在探讨C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞在E A U 发病中数量和功能的变化，以及其与E A U 发生、发展和转归的关系，实验结果显示C D

4、 4 + C D 2 5 + T r e g细胞在E A U 发病过程中呈现数量增高且功能增强，提示C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞孙敏博士学位论文：C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究中文摘要在E A U 的恢复期发挥重要作用。本课题的研究主要分为以下五个部分：第一部分：建立E A U 模型目的l观察E A U 炎症的发生、发展和转归以及眼局部病理改变。方法：将光感受器维生素A 类结合蛋白1 6 1 1 8 0 ( i n t e r p h o t o r e c e p t o rr e t i n o i d

5、- b i n d i n gp r o t e i n ，I R B P t 6 1 s s o ) 5 0 I t g 与完全弗氏佐剂( C o m p l e t eF r e u n d Sa d j u v a n t ，C F A )1 5 0 I _ t l 完全充分混合，于B 1 0 R I I I 小鼠皮下注射。百日咳毒素( P e r t u s s i st o x i n ，P T X )1 0 t t g 腹腔注射。将5 0 I - t lP B S 与1 5 0 t t lC F A 完全充分混合后皮下注射的小鼠作为对照组。自建立E A U 模型7 天后开始隔日进行

6、临床观察，自建立E A U 模型后8天、1 4 天、2 l 天、2 8 天行眼底病理切片观察。结果。临床和病理观察结果显示，自E A U 模型建立起8 - 9 天开始出现炎症，在第1 4 天时炎症达到高峰期，随后炎症迅速消退。在建立E A U 模型后的2 8 天，炎症全部消退。炎症主要表现为前房细胞、前房闪辉、前房渗出、视网膜以及脉络膜的严重损害。对照组则无炎症改变。结论：与对照组相比，E A U 模型炎症明显。第二部分E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞表达水平变化的研究目的：检测E A U , bg 发病过程中脾脏和淋巴结C D 4 + C D 2 5

7、+ T r e g 细胞的表达。方法：建立E A U 模型后的0 、7 、1 4 、2 1 和2 8 天，分离脾细胞，利用R T - P C R ( r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 检测F o x p 3m R N A 表达水平。在上述时间I I I孙敏博士学位论文：C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究中文摘要点分离脾细胞和引流淋巴结淋巴细胞，使用流式细胞术( F C M ) 检测表达F o x p 3的C

8、D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞比例的变化。结果：与正常小鼠相比，R T - P C R 结果显示，在建立模型后的第7 天F o x p 3 表达增高( p _ 0 0 0 1 ) ，1 4 天时达到高峰( p o 0 0 1 ) ，后一直维持在较高的水平直至检测的免疫后2 8 天。F C M 结果显示脾脏C D 4 + F o x p 3 + T 细胞的比例在第7 天时开始增高( 1 3 5 7 ，p 0 0 0 1 ) ，1 4 天时达到高峰( 1 9 7 3 ，p 0 0 0 1 ) ，后维持在一个较高的水平( 2 1 天1 6 8 5 ，p 0 0 0 1 ；2 8

9、 天1 7 9 6 ，p 0 0 0 1 ；4 2 天1 7 4 1 ，p 0 0 0 1 ) 。脾脏C D 4 + C D 2 5 + F o x p 3 + T 细胞频率变化与C D 4 + F o x p 3 + T 细胞的频率变化趋势基本一致，即免疫后7 天开始增高，1 4 天达到高峰，后一直维持在较高的水平，直至检测到的免疫后4 2 天。淋巴结C D 4 + F o x p 3 + T 细胞和C D 4 + C D 2 5 + F o x p 3 + T 细胞频率变化与脾脏这两群细胞的频率变化趋势一致。结论：在E A U 炎症发生发展过程中，F o x p 3 的表达和C D 4 +

10、 C D 2 5 + T r e g 细胞频率的变化与炎症的发展密切相关。第三部分E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞增殖抑制功能变化的研究目的：检测E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞对C D 4 + C D 2 5 T 细胞增殖的抑制功能。方法：分离1 4 天和2 8 天E A U 小鼠和对照组小鼠引流淋巴结淋巴细胞，采用免疫磁珠细胞分离法( M A C S ) 分选出C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞和C D 4 + C D 2 5 T 细胞。取注射巯基乙酸盐小鼠腹腔渗出细胞作为抗原递呈细胞(

11、A P C s ) 。在A P C s 和可溶性l t a g m la n t i C D 3 存在条件下，E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 T 细胞以不同比例与自体C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞共同培养或以l ：l 比例与对照组小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g细胞共同培养，共计培养7 2 小时后加入1 0 1 L t lW S T 8 ，再培养4 小时，采用酶标仪读数检测细胞增殖。结果：E A U 小鼠和对照组小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞在多克隆刺激下无明显增殖。孙敏博士学位论文：C D 4 +

12、C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究中文摘要炎症期和恢复期E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞对C D 4 + C D 2 5 T 细胞抑制功能显著强于对照组小鼠( 1 4 天8 9 3 ，p 0 0 0 1 ；2 8 天6 4 0 ，p = 0 0 2 7 ；对照组4 4 2 ) 。结论sE A U 炎症期、恢复期和对照组小鼠C D 4 + C D 2 5 * T r e g 细胞均具有无能和抑制特征。炎症期和恢复期E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞的抑制增殖功能显著上调，可能与E

13、A U 疾病的恢复关系密切。第四部分E A U 小鼠C I ) 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞对细胞因子分泌抑制功能变化的研究目的：检测E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 十T r e g 细胞对C D 4 + C D 2 5 T 细胞产生细胞因子的抑制功能。方法。取1 4 天和2 8 天E A U 小鼠以及对照组小鼠引流淋巴结，分离淋巴细胞。C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞、C D 4 + C D 2 5 T 细胞和A P C s 的分选和处理如前所述。在可溶性的l l a g m la n t i C D 3 和A P C s 存在的条

14、件下，E A U 小鼠或对照组小鼠C D 4 + C D 2 5 T 细胞分别以l ：l 比例与对照组小鼠或E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g细胞共同培养。在培养3 天时，移取上清，用E L I S A 方法检测上清中I F N 吖和I L 1 7 水平。结果：炎症期E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 T 细胞培养上清中I F N 吖的水平( 2 5 5 5 + 4 8 5 p g m 1 ) 显著高于对照组小鼠( 1 4 3 1 士2 4 7 p g m lp 0 0 0 1 ) ，恢复期小鼠C D 4 + C D 2 5 T 细胞培养上清中I F

15、 N 吖的水平( 1 0 7 3 士3 4 5 p g n ：1 1 ) 显著低于对照组小鼠( p = 0 0 3 2 ) 炎症期和恢复期E A U 小鼠C D 4 十C D 2 5 T 细胞与C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞共同培养上清中I F N 吖的水平显著低于对照组小鼠( 炎症期3 5 8 士4 5 p g r n lp 0 0 0 1 ；恢复期5 0 2 士1 1 8 p g n ap = 0 0 0 3 ：对照组7 5 8 士1 6 1 p g m l 。炎症期和恢复期E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 T 细胞培养上清中I L - 1 7的水平

16、显著高于对照组小鼠( 炎症期1 9 4 9 0 士5 7 6 8 p g m lp 0 0 0 1 ；恢复期V孙敏博士学位论文：C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性自身免瘦性葡萄膜炎中作用的研究中文摘要5 4 9 0 4 - 1 8 7 5 p g m lp O 0 0 1 ；对照组2 1 6 4 4 - 6 8 5 p g m 1 ) ，E A U 炎症期、恢复期和对照组小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞对C D 4 + C D 2 5 。T 细胞分泌I L 1 7 无显著抑制和促进作用。结论s炎症期和恢复期E A U 小鼠C D 4 + C

17、D 2 5 + T r e g 细胞对I F N - 1 , 的分泌强于对照组小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞，而对上调的I L 1 7 无显著抑制或促进作用。第五部分过继转移C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞对E A U 影响的研究目的：探讨过继转移C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞对E A U 发病的影响。方法：取1 4 天和2 8 天E A U 小鼠和对照组小鼠引流淋巴结，分离淋巴细胞。采用M A C S 法分选出C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞，通过鼠尾静脉注射到正常小鼠体内，同时建立E A

18、 U 模型。建立E A U 模型后1 4 天，病理切片观察炎症的严重程度结果：过继转移炎症期和恢复期E A U 小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞可以显著抑制E A U 的严重程度( 炎症期1 3 4 - 0 3p - - - - 0 0 0 1 ；恢复期1 5 4 - 0 6p - - - - 0 0 2 7 ) ，过继转移对照组小鼠C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞虽然可以轻度抑制炎症的严重程度，但并无统计学意义( 2 4 4 - 0 5p = 0 2 3 5 ) 。结论：通过体内实验进一步证明炎症期和恢复期E A U 小鼠C D 4 + C

19、 D 2 5 + T r e g 抑制功能增强，可能参与抑制炎症活动，加速了E A U 的恢复。全文总结：本研究中C D 4 + C D 2 5 + 1 r c g 细胞表达和抑制功能在炎症期和恢复期E A U 小鼠体内显著上调的结果表明C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞数量增加和功能增强可能加速E A U 炎症的迅速恢复。关键词：C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞、实验性自身免疫性葡萄膜炎E A U 、叉头翼状螺旋转录因子F o x p 3 、I F N 吖、I L 1 7V I孙敏博士学位论文：C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性

20、自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究英文摘要T h er o l eo fC D 4 + C D 2 5 + r e g u l a t o r yTc e l l si nt h ed e v e l o p m e n to fE x p e r i m e n t a lA u t o i m m u n eU v e o r e t i n i t i sM a jo r：O p h t h a l m o l o g yP h DC a n d i d a t e ：M i nS u nS u p e r v i s o r：P r o f P e i z e n gY a n gA b

21、s t r a c tB a c k g r o u n d ：C D 4 + C D 2 5 + r e g u l a t o r yTc e l l s ( T r e gc e l l s ) ，af u n c t i o n a l l yd i a i n c ts u b p o p u l m i o no fTc e l l sd i f f e r e n t i a t e di nt h en o r m a lt h y m u s ，p l a yac r i t i c a lr o l ei nt h em a i n t e n a n c eo fp e

22、r i p h e r a ls e l f - t o l e r a n c et h r o u g h o u tt h el i f e s p a no fa ni n d i v i d u a l F u n c t i o n a la b r o g a t i o no rd e f i c i e n c yo fC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l sh a sb e e ns h o w nt ob er e s p o n s i b l ef o rt h ed e v e l o p m e n to fv a r i o u sa

23、 u t o i m m u n ed i s e a s e s C D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l ss p e c i f i c a l l ye x p r e s sF o x p 3 ，at r a n s c r i p t i o nf a c t o rt h a ti sg e n e r a l l yc o n s i d e r e da sas p e c i f i cm o l e c u l a rm a r k e rf o rC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l si n I nt h ea b

24、s e n c eo fF o x p 3 - e x p r e s s i n gC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l s ，a u t o r e a c t i v eT c e l lc l o n e sm a yb e c o m ea c t i v a t e da n di n d u c es e v e r ea n dw i d e s p r e a da u t o i m m u n ed i s e a s e E x p e r i m e n t a la u t o i m r n u n eu v e o r e t i n

25、 i t i s ( E A U ) ，a no r g a n - s p e c i f i ca u t o i m m u n ed i s e a s em o d e l ，h a sb e e nw i d e l yu s e da sam o d e lf o rh u m a ni n t r a o c u l a ri n f l a m m a t i o n H i s t o p a t h o l o g i c a l l y E A Ui ss i m i l a rt oh u m a nu v e i t i s An u m b e ro fg r o

26、 u p sh a v er e c e n t l ys h o w nt h a tb o t hT h l a n dT h l7 e f f e c t o rTc e l l s ( T e f fc e l l s ) p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed e v e l o p m e n ta n dm a i n t e n a n c eo fE A U E A Ud i f f e r sf r o mh u m a nu v e i t i sb yt h ef a c tt h a tt h em o d e lh a

27、 sas t r i k i n gm o n o p h a s i en a t u r e ，w h e r e a sh u m a nd i s e a s eo f t e np r e s e n t sa sac h r o n i cr e l a p s i n gc o n d i t i o n T r e gc e l l sm a ye v o l v ed u r i n gE A Ua n do f f e ra ne x p l a n m i o nf o ri t sm o n o p h a s i cn a t u r e V I I孙敏博士学位论文：

28、C I M + C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究英文摘要F i v es e c t i o n sw e r ei n c l u d e di nt h i ss t u d y ：P a r tIP u r p o s e ：T oo b s e r v et h ed i s e a s ep r o c e s sa n dp a t h o l o g i c a lc h a n g e so fE A U M e t h o d s ：F o ri n d u c t i o no fE A U ，B10 R I I Im i c ew

29、e r ei m m u n i z e ds u b c u t a n e o u s l yw i t ha2 0 0 p Ie m u l s i o nc o n m i m n g5 0 肛gI R B P l 6 1 1 8 0i nC F A P T X ( 1 O p g ) W a sc o n c u r r e n t l yi n j e c t e di n t r a p e r i t o n e a l l ya sa na d d i t i o n a la d j u v a n t C o n t r o lg r o u p so fm i c er

30、 e c e i v e da ne m u l s i o no f5 0 I _ t lP B Sa n d15 0 1 a lC F A R e s u l t s ：T h i si n f l a m m a t i o nw a sa l r e a d ye v i d e n to nd a y8 - 9a n dr e a c h e di t sp e a kb yd a y14 ，f o l l o w e db yar a p i dr e g r e s s i o n T h ei n f l a m m a t i o nw a sc h a r a c t e

31、r i z e dc l i n i c a l l yb ya q u e o u sf l a r e ，c e l l s ，e x u d a t e sa n ds e v e r ec h a n g e si nt h er e t i n aa n du v e a T h e r ew a sn oi n f l a m m a t i o ni nt h en o r m a lm i c eo rc o n t r o lm i c ei m m u n i z e dw i t hC F Ao n l y C o n c l u s i o n ：C o m p a r

32、 e dw i t hc o n t r o lg r o u p s ，E A Um i c eh a de v i d e n ti n f l a m m a t i o nw i t has t r i k i n gm o n o p h a s i cn a t u r e P a r tI IP u r p o s e ：T oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l so fE A Um i c e M e t h o d s ：S p l e n o c y

33、 t e sw e r eo b t a i n e df r o mn o r m a lm i c ea n dt h o s eE A Um i c ea f t e ri m m u n i z a t i o no n , l a y s7 ，14 ，21a n d2 8 T h em R N Al e v e lo fF o x p 3f r o md i f f e r e n tt i m ep o i n t sW a sd e t e r m i n e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s

34、 ec h a i nr e a c t i o n( R T - P C R ) T h ef r e q u e n c i e so fC D 4 + F o x p 3 + Tc e l l sa n dC D 4 十C D 2 5 + F o x p 3 + Tc e l l si ns p l e n o c y t e sa n dl y m p h c y t e sw e r ea s s e s s e db yf l o wc y t o m e t r ya tt h ea f o r e m e n t i o n e dt i m ep o i n t s R e

35、s u l U ：F o x p 3m R N Al e v e l si nt h es p l e n o c y t e si n c r e a s e do nd a y70 - - 0 0 01 ) ，r e a c h e dap e a l 【o nd a y1 4 ( p O 0 0 1 ) ，a n dt h e nm a i n t a i n e dah i 曲l e v e lu n t i ld a y2 8 F C Ma n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ef r e q u e n c i e so fC D 4 + F o

36、x p 3 + Tc e l l sa n dC D 4 + C D 2 5 + F o x p 3 + Tc e l l sw a sh i g h e ro nd a y7 ，r e a c h e di t sp e a ko nd a y14a n dt h e nm a i n t a i n e da tah i g h e rl e v e l 孙敏博士学位论文：C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究英文摘要C o n c l u s i o n ：A ni n c r e a s e de x p r e s s i o no

37、fC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l sw a so b s e r v e di nt h eE A Um i c e ，a n dt h eu p r e g u l a t i o no fF o x p 3p o s i t i v er e g u l a t o r yTc e l l sp a r a l l e l e dt h er e s o l u t i o no fu v e i t i s P a r t P u r p o s e ：T oa s s a yt h ei n h i b i t o r ye f f e c to fC

38、 D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l so np r o l i f e r a t i o no fC D 4 + C D 2 5 Tc e l lp o p u l a t i o ni nE A Um i c e M e t h o d s ：A td a y s14o r2 8f o l l o w i n gI R B Pi m m u n i z a t i o n C D 霹C D 2 5 + Tc e l l sa n dC D 4 + C D 2 5 Tc e l l sw e r ei s o l a t e df r o mm o u s el

39、y m p h o c y t e so b t a i n e df r o md r a i n i n gl y m p hn o d e su s i n gM A C S I n t r a p e r i t o n e a li n j e c f i o no ft h i o g l y c o l a t eW a sp e r f o r m e da n dp e r i t o n e a le x u d a t e sc e l l s ( P E C s ) w e r ch a r v e s t e dt h r e ed a y sl a t e ra n

40、 du s e da sa n t i g e n p r e s e n t i n gc e l l s ( A P C s ) I nt h ep r e s e n c eo fP E C 锻A P C s ，C D 4 + C D 2 5 rc e l l sf r o mE A Um i c ew e r ec u l t u r e dw i t ho rw i t h o u tv a r i o u sn u m b e r so fC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l s F o rc r o s s o v c l e x p e r i m

41、e n t s ，C D 4 + C D 2 5 Tc e l l sf r o mc o n t r o lg r o u p si nt h ep r e s e n c eo fA P Cw e r em i x e da tar a t i oo f1 ：1w i t hC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l sf r o mE A Um i c e ，a n dv i c ev e r s a A n t i - - C D 3m A ba taf i n a lc o n c e n t r a t i o no flp g m lw a sa d d e

42、 dt ot h ec u l t u r ef o rs t i m u l a t i o n E v e n t u a l l y 10 l _ t lW S T - 8( 2 一( 2 一m e t h o x y 一4 一n i t r o p h e n y l ) 3 ( 4 n i t r o p h e n y l ) 5 一( 2 ，4 一d i s u l f o p h e n y l ) 2 H t e t r a z o l i u m ，m o n o s o d i u r ns a l 0w a sa d d e da n di n c u b a t e

43、df o r4 h T h ea b s o r b a n c eW a sd e t e r m i n e da t4 5 0 n mu s i n ga ne n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e ma s s a y R e s u l t s ：T h er e s u l t sr e v e a l e dt h a t ，a tar a t i oo f1 ：1 ，C D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l si s o l a t e df r o mE A Um i c eo nd a y14o r2 8

44、a f t e ri m m u n i z a t i o ns u p p r e s s e dC D 4 + C D 2 5 rc e l lp r o l i f e r a t i o nb ya l la v e r a g eo f8 9 3 o r6 4 0 r e s p e c t i v e l y ，w h i c hW a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to b s e r v e dw h e nu s i n gc e l l so b t a i n e df r o mc o n t r

45、o lm i c e ( 4 4 2 ) ( d a y1 4p 0 0 01 ；d a y2 8p = 0 0 2 7 ) C o n c l u s i o n ：T h ea n e r g i ca n ds u p p r e s s i v ep r o p e r t yo fC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l si nb o t hE A Um i c e a n dc o n t r o lg r o u p sw e r eo b s e r v e d T h ef u n c t i o no fC D 4 + C D 2 5 + T r

46、e gc e l l sW a si n d e e ds t r e n g t h e n e di nE A Um i c e ，w h i c hm a yb ec l o s e l ya s s o c i a t e dw i t ht h er e g r e s s i o no fE A U I X孙敏博士学位论文：C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究英文摘要P a r t P u r p o s e ：T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to ft h eC D 4 + C D

47、2 5 + T r e gc e l l so nt h ec y t o k i n e sp r o d u c t i o nb yT h l T h l 7c e l l sf r o mE A Um i c e M e t h o d s ：A td a y s14o r2 8f o l l o w i n gI R B Pi m m u n i z a t i o n ，C D 4 十C D 2 5 Tc e l l s ，C D 4 十C D 2 5 + Tc e l l sa n dA P C sw e r ei s o l a t e da n dt r e a t e da

48、 sp r e v i o u sd e p i c t i o n W i t ht h es t i m u l a t i o no fa n t i C D 3m A ba tac o n c e n t r a t i o no f1l a g m l ，C D 4 十C D 2 5 Tc e l l sf r o mE A Um i c eo rc o n t r o lg r o u p si nt h ep r e s e n c eo fA P C sw e r ec u l t u r e dw i t hC D 4 十C D 2 5 + T r e gc e l l sf

49、 r o mc o n t r o lg r o u p so rE A Um i c ef o r3d a y s T h es u p e r n a t a n tW a sr e m o v e df r o mc u l t u r e sf o ra n a l y s i so fc y t o k i n ep r o d u c t i o n L e v e l so fI L 17a n dI F N 吖w e r em e a s u r e du s i n gm o u s eD u o s e tE L I S Ad e v e l o p m e n tk i

50、t s R e s u l t s ：T h er e s u l t so ft h eE L I S Ao ns u p e m a t a n t so b t a i n e df r o mt h ep r o l i f e r a t i o ne x p e r i m e n t sd e s c r i b e da b o v es h o w e das i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dI F N 吖l e v e lo nd a y14( d a y l 4V Sc o n t r o l ，p 0 0 0 1 ) ，b

51、 u tal o w e rl e v e lo ft h i sc y t o k i n eo nd a y2 8 ( d a y 2 8v sc o n t r o l ，p = 0 0 3 2 ) W h e nc u l t u r e dw i t hC D 4 十C D 2 5 十T r e gc e l l s ，I F N - q , p r o d u c t i o nb yC D 4 十C D 2 5 Tc e l l sW a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e db o t hi nc o n t r o lg r o

52、 u p sa n di nt h eE A Um i c eo nd a y1 4a n d2 8a f t e ri m m u n i z a t i o n As t r o n g e ri n h i b i t i o nW a sn o t e di nt h ei m m u n i z e dm i c ea sc o m p a r e dw i mt h a ti nc o n t r o lg r o u p s ( d a yl4P 0 0 01 ；d a y 2 8P = 0 0 0 3 ) As i g n i f i c a n t l yh i g h e

53、rp r o d u c t i o no fI L 17b yC D 4 + C D 2 5 Tc e l l sW a so b s e r v e di nt h em i c ef o l l o w i n gi m m u n i z a t i o no nd a y14 ，a sc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p s ( P 0 0 01 ) A ni n c r e a s e dp r o d u c t i o no ft h i sc y t o k i n e ，a l t h o u g hl o w e rt

54、h a nt h a to b s e r v e di nt h em i c eo nd a y14 ，W a sa l s on o t e di nt h em i c eo nd a y2 8 ( p 0 0 01 ) W h e nt h e s ec e l l sw e r ec o c u l t u r e dw i t hC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l se i t h e rf r o mi m m u n i z e dm i c eo rf r o mc o n t r o lg r o u p s ，w ed i dn o to

55、b s e r v eas i g n i f i c a n tc h a n g ei nt h ep r o d u c t i o no fl L 17b yC D 4 十C D 2 5 Tc e l l s C o n c l u s i o n ：C D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l sf r o mE A Um i c ew e r ei n h a n c e di ni n h i b i t i n gt h es e c r e t i o no fI F N l , ，b u tc o u l dn o ti n f l u e n c et

56、 h es e c r e t i o no fl L 17P a r tVP u r p o s e ：T of u r t h e ri d e n t i f yt h ei n h i b i t o r yf u n c t i o no fC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l sd u r i n gX孙敏博士学位论文：C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中作用的研究英文摘要t h ed e v e l o p m e n to fE A U M e t h o d s ：C D 4 + C D 2 5 + T r

57、 e gc e l l sw e r es o r t e da n dr e s u s p e n d e di np h y s i o l o g i c a lp h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ( P B S ) f r o mc o n t r o lm i c ea n di m m u n i z e dg r o u p so nd a y s14o r2 8a n dw e r ei n j e c t e di n t r a v e n o u s l yi n t on a f v es y n g e n

58、e i cm i c eo nt h ed a yo fi m m u n i z a t i o n 、 ，i mI R B P l 6 1 1 8 0t oi n d u c eE A U O nd a y1 4 ，e y e sw e r ee n u e l e a t e df r o me a c hg r o u pa n ds t a i n e db ys t a n d a r dH Es t a i n i n g R e s u l t s ：T r a n s f e ro fC D 4 + C D 2 5 + T r e gc e l l so b t a i n

59、e df r o mi m m u n i z e dm i c eo nd a y14o r2 8c o u l ds u p p r e s st h ea c t i v i t yo fE A U ( d a yl4p 0 0 01 ；d a y 2 8p = O 0 0 4 ) T r a n s f e ro fT r e gc e l l so b t a i n e df r o mc o n t r o lg r o u p ss h o w e das l i g h td e c r e a s ei nt h ei n t e n s i t yo fE A U ，w

60、h i c hd i dn o tr e a c hs t a t i s t i c a ld i f f e r e n c ew h e nc o m p a r e d 研t l lt h ei m m u n i z e dm i c et h a th a dn o tr e c e i v e dc e l l s ( p = O 2 3 5 ) C o n c l u s i o n ：U s i n gt h ei nv i v oe x p e r i m e n t s ，w ec o u l dg e tt h ec o n c l u s i o nt h a tt