地高辛标记探针的Southern杂交技术

1、地高辛标记探针的Southern杂交技术地高辛标记探针的Southern杂交技术根据核酸变性与复性的特性，特定核昔酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条 件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。将已知的特定核 甘酸序列的单链DM或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否 存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的 检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。它可用于基因组特定DA序 列的定位，测定相关片段的同源性、从cDA文库、基因组文库中筛选完整基因 等。还可以用于构建DA分子的酶切图谱和遗传图一指纹分析等。核酸杂交检测都是在

2、滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜 等。其基本过程包括以下儿步。首先将待检样品DA或RNA分子直接点加到滤膜 上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按 其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting) > 菌落和嗜菌斑印迹法(colony and plaque blotting):然后将具 有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。最 后，经过放射自显影技术或

3、光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有 无和深浅判定结果。根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下儿 种:斑点杂交技术(Dot blot) > Southern 杂交技术(Southern blot)、Northern 杂 交技术(Northern blot) o前两者用于检测DYA,后者用于检测RNA。本实验主要介 绍Southern杂交技术。1主要内容1. Southern Blot方法的原理。2. DNA琼脂糖凝胶电泳。3. DNA转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜及膜处理。4. 介绍随机引物法标记DA探针，Southern blot的预杂交、杂交及显色过 程。2目的

4、要求掌握Southern blot方法的原理;掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移DNA至硝酸纤维素膜及膜处理。3实验原理Southern杂交技术是山Edward M. Southern在1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交技术，并因此而得名。Southern杂交的原理是将待检测的DNA 分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其 在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记 物标记的DA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱 基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而

5、 显示出待检的片段及其相对大小。Southern印迹杂交技术包括两个主要过程:一是将待测定核酸分子通过一定的 方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹 (blotting);是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度 下退火，即分子杂交过程。见图1。图1. Southern blot印迹杂交原理示意图(a)核酸内切酶消化的基因组DNA;琼脂糖凝胶电泳分离DA片段；(c)凝胶中的DNA谱带转移到硝酸纤维素滤膜上；(d)滤膜与标记的DNA分子探 针杂交；(e)显色显示杂交的DA谱带。Southern blot方法十分灵敬，在理想的条件下，用放射性同位素标记

6、的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2隅DA也能被清晰地检测出来。、实验仪器：尼龙膜;恒温水浴，塑料带，剪刀，平头银子，封口机，烤箱，台式高速离心 机，高压灭菌锅，电泳仪，水平电泳槽，微量移液器，摇床，吸水纸，3MM Whatman滤纸，干烤皿，玻璃平台等。二、溶液配制1(待检基因组DYA、DIG标记和检测试剂盒、各种限制性内切酶等。2(其他试 剂(1) 20 X SSC(1000 mL):组分浓度3. 0M的Nacl, 0. 3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88. 26gNaOH 调 pH 值到 7. 0,(2) 洗涤缓冲液 Washing buffer 200ml

7、组分浓度:0. IM Maleic acid, 0. 15M Nacl; pH 7.5(20?); 0. 3%(v/v)Tween20.马来酸：2. 32gNacl: 1. 75gTween20 0. 6mlNaOH固体约1. 7g调pH值7. 5(3) 马来酸缓冲液 Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0. IM Maleic acid, 0. 15M Nacl; pH 7.5 (20°C)马来酸：2. 32gNacl: 1. 7ogTween20 0. 6m1NaOH固体约1. 7g调pH值7. 5(4) 检测缓冲液 Detection buffer 100

8、ml9. 5(20°C)组分浓度:0. IM Tris-HCl, 0. IM Nacl, pHTris 1. 21g,NaCl 0. 584gMgCll. Olg 2调ph值到9. 5(5) 变性溶液(500 mL) : 1 mol/L NaCl (43. 83 g),0.5 mol/L NaOH (10g),(6)中和溶液(500 mL) :0. 5 mol / L Tris (30. 27 g), 3 mol/L NaCl(87. 66 g),用 1mol/L HC1 调(7) 5 X TBE (250 mL):13. 5g Tris 6. 9g 硼酸，0. 9 g EDTA-N

9、a2,定容 250 mL(8) 6 X澳酚蓝载样液：0. 25，澳酚蓝，40 ,蔗糖(9) IM Tris-HCl (pH 8. 0):称取 12. U4g Tris-base,溶于 80ml 蒸憾水中，用HC1调pH至8.0后，用蒸憾水定容至100ml,高压灭菌，分装保存。(10) 0. 5MEDTA (pH 8. 0):称取 18. 61g EDTA,溶于 80ml 蒸镭水中，用 N&0H 调pH至8.0后，用蒸憎水定容至100ml,高压灭菌，分装保存。(11) TEbuffer :取 IM Tris-HCl (pH 8. 0) 5ml, 0. 5M EDTA (pH 8. 0)

10、lml,用蒸憎水定容至500ml,调pH至8.0后，高压灭菌，分装保存。(12) 10% SDS:称取10g SDS,溶于90ml蒸憾水中，68?加热溶解，用盐酸调pH至7. 2,定容至100mlo(13) 低严谨度洗膜液:将20 X的SSC用蒸憾水稀释成2 X SSC,并按照 100:1( 2X SSC: 10% SDS)加入 10% SDS,配成 2 XSSC 0. 1% SDS。(14)高严谨度洗 膜液:将20 X的SSC用蒸镭水稀释成0.5 X SSC,并按照100:1(0.5 X SSC: 10% SDS)加入 10% SDS,配成 0. 5XSSC 0. 1% SDS。(15) B

11、locking Solution：用 Maleic acid buffer 将 6#中的 10 X Blocking Solution 稀释成IX的工作液，现配现用。(16) Antibody Solution :将 4#试剂离心，按照 1:5000 加入 BlockingSolution, 28?可保存12小时，即每5ml Blocking Solution中加lul Ab抗体，与地高辛标记探针结合。(17) Color substrate solution (显色液)：将 5#试剂按照 1 ：50 用 Detection buffer 稀释，即从5#中取100ul加入5ml Detecti

12、on buffer,要避光，现配现用，用 于显示抗体结合位点。(18) 杂交液DiG Easy Hyb：将64ml无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37 °C摇动溶解5mino三、基因组DA的提取、酶切与电泳分离(1) 酶切反应体系DNA lug / u 1 15 u g10X 酶切 buffer 5 P 1限制性内切酶(lOU/ul) 6 Ml加 ddH20 至 50 Ml(2) 混匀后于37° C酶切l-3h,酶切完成后，取3ul酶切反应物电泳分析， 检测酶切效果(3) 酶切完成后，加入EDTA, 65?加热灭活限制酶，样品即可直接进行电泳分 离，必要时可进行乙醇沉淀

13、，浓缩DA样品后再进行电泳分离。四、琼脂糖凝胶电泳(1) 用0.5 X TBE配制0.8%的琼脂糖凝胶，凝胶厚度约为0.5 cm。 (2) 待凝胶充分凝固后，在点样孔中依次加入:阳性对照:质粒酶切产物，阴性对照:水 及检测样品。(3) 加入电泳缓冲液至刚好与胶面持平，加100 V电压，电泳5 min待漠酚蓝 进入胶中后，将电压降至80 V电泳30min,(4) 电泳结束后，染色，长波紫外线下观察电泳结果，用1张保鲜膜覆盖在 凝胶上，复制下各分子量参照物及各DNA样品带的位置，在凝胶旁置1标尺照像五、变性与转膜(1) 将胶浸于4倍体积的变性溶液中，在摇床上温和摇动2 X 15 min,变性 液要

14、能没过胶。(2) 将胶在双蒸水中稍微洗涤，然后放入4倍体积的中和溶液中，在摇床上温 和摇动2 X 15 min,中和液要能没过胶。(3) 转膜：20XSSC浸湿一张Whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比 凝胶稍大，形成一个“桥”，凝胶反放在浸湿的Whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。(4) 照凝胶的大小剪一张硝酸纤维素滤膜/尼龙膜(长，宽略大0.2cm,剪去与凝 胶对应的一角)。膜放在凝胶上。(5) 尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸(长，宽略小0. 2cm)叠吸水纸、上置一 玻璃板，其上放一重约0.2,0.5kg的物品。在20XSCC的转移缓冲液中充分转移

15、1& 24h及时换掉浸湿的吸水纸。(6) 固定:将膜在2 X SSC溶液中短暂漂洗，除去过多的盐分，然后DNA结 合面朝上，放在一张干净的滤纸上晾干后，夹在两层滤纸中间，12(TC烘箱中30 min,或者80°C 2h,促进DNA与硝酸纤维素滤膜/尼龙膜结合。Weight (200-500 g)Glass plateStack of paper towelsBridge, resting In a reservoir of 20x SSC六、预杂交与杂交(1) 预杂交DiG Easy Hyb：将64ml无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37 °C2摇动溶解5min

16、,预热一定体积的DiG Easy Hyb (10ml/100cm膜)至杂交温度 42°C。预杂交60min,在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42C下充分润 湿。(此过程可以延长至数小时)(2) 探针变性:Dig标记的探针lul (约25ng/ml)加40M H0, 95 °C变性 10min2后迅速放在冰上冷却lOmino(3) 杂交:将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb (3. 5ml/100cm2)中，混匀， 避免泡沫，倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液，继续在42 °C下温 浴过夜(单拷贝探针)。含有探针的DiG Easy

17、 Hyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20 °C保存，可重复使用儿次，只需在使用前于68 °C处理10min即可，不要煮沸DiG Easy Hyb杂交液七、洗膜与显色(1)洗膜:2XSSC, 0. 1% SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。0. 5XSSC, 0. 1% SDS 65-68°C温和振荡15分钟,洗2次(2)免疫与显色：a. 杂交和洗膜后，用马来酸缓冲液(Washing Buffer, Bufferl)浸泡l-5minb. 在 100ml 1 X Block solution (Buffer2)中温育 30minc. 用1 XBlock solution(Buffer2)稀释抗体-DIG-抗原偶联物至 150mU/ml(1:5000)d. 用 10ml antibody solution 处理膜 30mine. 用100ml马来酸洗膜15min,洗2次f. 在 20ml detection buffer (Buffer3)中平衡 2-oming. 在8ml新鲜配制的color substrate s