牛布鲁氏菌病诊断技术研究

1、牛布鲁氏菌病诊断技术研究布鲁氏菌病(Brucellosis, 乂称布氏杆菌病、地中海弛张热、马耳他热、波 浪热或波状热，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种变态反应性人畜 共患传染病。其最早于1887年由David Bruce在患病死者脾脏中发现并分离鉴 定。我国则在1905年首次报道该病流行。目前,除少数发达国家以外，布病在全 球160多个国家流行。布病作为重要的人畜共患病之一，其主要感染牛、羊、猪和犬等动物，其中以 牛和羊的感染情况最为严重。布病可通过消化道、皮肤黏膜以及垂直传播等多种 方式引起动物感染,其中最为危险的传染源为患病的妊娠动物，布鲁氏菌可伴随 流产或分娩时的胎

2、儿、胎衣和羊水排出，另外乳汁也是重要的传染源之一。布病最为显著的临床症状为生殖障碍，引起怀孕母畜流产，常见于妊娠中后 期,且长期不孕;对于公畜來说，则引起睾丸炎和附睾炎，严重影响生殖性能。布病 常伴随着波状热、关节炎等其他临床症状的发生。另外，布鲁氏菌作为胞内寄生菌，一口感染个体后难以通过抗生素治疗，即使 动物自愈，仍然有持续排菌的危险，所以免疫加检疫是控制和预防布病的皐本方 式。目前布病是中华人民共和国传染病防治法规定的35种传染病中的乙类 传染病，同时并被列为二类传染病。目前，对丁布病的检测方法大都建立在体液免疫基础上，传统的检测方法有 虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)

3、、补体结合试验(CFT)等,但传统 方法耗时较长，方法繁琐且判断较为困难，结果判定十分依赖于相关人员的经验。匕世纪70年代,随着郴关技术的发展，酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光偏振实 验(FPA)也被应用于布病的检测Z中。然而由于技术限制,我国使用的动物布病ELISA检测试剂盒一直被国外厂商 垄断，使得产生了高昂的检测成本;而且，我国现有的预防动物布病的疫苗如猪种 S2株、牛种A19株和羊种M5株均为光滑型菌株，其免疫后产生的抗体与自然感 染Z间存在干扰，使得现有手段无法区分动物的具体状态。国外有些国家(如美国、 加京大等)通过使用粗糙型疫苗的方式解决了该问题，但由于我国还未有有效的 粗糙

4、型疫苗使用，使得我国对于动物布鲁氏菌的有效检疫和及时淘汰变得更加困 难。为了解决上述问题，本研究针分别建立了针对动物布鲁氏菌病的竞争ELISA 抗体检测试剂盒和牛布鲁氏菌病间接ELISA抗体检测方法，同时建立了针对牛布 曾氏菌IgM亚型抗体的检测方法，构建了不同感染/免疫状态下的动物模型，并借 鉴了之前的研究,确定了不同状态下牛体液免疫情况，建立了基于牛不同布鲁氏 菌抗体亚型的鉴别诊断方法。同时,本研究针对现有检测手段均仅限丁检测体液 免疫状态的局限,通过对刺激源的选择，并借鉴牛结核分枝杆菌病的相关手段，建 立了针对牛布鲁氏菌的ifn-丫释放试验的检测方法。本研究通过单 克隆细胞制备技术筛选到

5、针对布鲁氏菌的特异性单抗细胞株 (4c3株)，并通过棋盘交叉法确定了包被浓度、酶标抗体稀释度、样品稀释度、 样品稀释液等条件，建立了动物布鲁氏菌抗体竞争elisa检测方法。在此条件下 该方法的敏感性为97. 9%,特异性为96. 3%e本研究同时以提纯的布鲁氏菌脂多糖(Ips)抗原，按照上述方法分别建立了 针对布鲁氏菌特异性igg和igm亚型抗体的检测方法，其敏感性分别达到97. 7%和95. 7%,特异性分别为95. 5%和92%。而且，上述建立的间接elisa方法对与布 鲁氏菌具有相同抗原为点的小肠结肠炎耶尔森氏菌。：9和大肠杆菌。:157抗血清 无交叉反应性，证明了本研究建立方法的良好特

6、异性。本研究在建立的分别针对布鲁氏菌igg和igm抗体亚型检测方法的基础上， 通过构建易感动物（奶牛）模型，获得我国常用疫苗（猪种布鲁氏菌s2弱毒苗和牛 种布鲁氏菌al9弱毒苗）以及标准强毒株（牛种布鲁氏菌2308株）的抗体规律。通 过检测发现,s2疫苗口服后在整个检测期内（0'150天）其igg的含量均低于临界 值,而igm则在免疫15天后达到最高，之后逐步下降，并在免疫后60天后低于临 界值;皮下注射al9免疫组其igg和igm则在15天后即达到高峰,之后均迅速下 降，igg在感染后90天，igm则在60天后低丁临界值;与s2组和al9组不同，攻毒 对照组其igg在21'3

7、0天时出现后则一直保持稳定水半，而igm亚型抗体出现时 间也比免疫组延迟，迅速达到高峰后持续下降。这表明不同疫苗之间以及与野毒株之间其抗体亚型有明显的差别，通过这些 区别，可以通过检测抗体亚型的方法來对牛群不同状态进行鉴别。为了验证本方 法的可行性,本研究对背景清晰的50份样本进行检测，通过上述建立的鉴别诊断 方法，判断了其真实状态，除个别因处于交叉范围外，其他样本（46/50）均可进行 实施鉴别诊断，准确度为92%。本研究通过借鉴牛结核病的ifnY相关检测方法，确定了 1.0X107cfu/ml 的灭活牛种2308抗原作为牛布鲁氏菌病ifn-丫释放试验的最佳抗原，并对感染 牛群进行检测，结果发现ifn-Y释放试验可将检测时间点提前到感染后5天,相 较于传统抗体检测方法，提前了 2、3周。说明该方法可以增强对于布鲁氏菌病的 检测效果，对丁尽早发现和处理阳性个体具有重要意义。最后，本研究建立的动物布鲁氏菌竞争ELISA检测方法、牛布鲁氏菌间接 ELISA检测方法能够有效检测牛布鲁氏菌病的感染,相较于传统检测方法更加方 便