金荞麦对溃疡性结肠炎的抗炎作用及机制研究

1、金荞麦对溃疡性结肠炎的抗炎作用及机制研究 背景和目的 溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis, UC) 属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)的一种,中医学归于“腹痛”、“泄泻”、“便 血”等范畴。其病因尚不十分明确，现代研究表明核转录因子-k B(nuclear factor, NF- k B)信号通路、炎症小体信号通路(Inflammasome) NLRP3与溃疡性 结肠炎的发生、发展密切相关 , 并导致一系列炎症因子的释放。目前，临床上缺乏对UC的有效且副作用少的治疗药物，中草药因其安全、低 毒、有效等优点受到广泛关注。金养麦(Fa

2、gopyrumcymosum,FAG),是一种蓼科的 草本植物根茎和荞麦物种 ,传统被广泛用于治疗肺炎 ,菌痢等,临床及实验研究表 明,FAG对腹泻性肠易激综合征治疗亦有效，其机制可能与其抗炎、肠黏膜保护作 用相关,但目前未见金养麦对溃疡性结肠炎的作用及机制的深入研究报道。本课题拟从以下四部分研究： 一：金养麦提取物中主要活性成分在溃疡性结肠炎小鼠胃肠道的分布研究；二：金养麦提取物对TNBS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的药效学研究；三：金养麦提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠药效学研究； 四：从NF-k B及NLRP3言号通路角度研究金养麦提取物的抗炎机制。期望通过 上述研究 , 进一步确证金养麦

3、提取物对溃疡性结肠的治疗作用 , 并初步探讨其机 制。研究方法及结果在第一部分研究中我们首先建立采用HPLC法同时测定了金养麦提取物中原儿茶酸，儿茶素,表儿茶素,原花青素B1,原花青素B2的分析方 法。采用外标法 , 求得样品中原儿茶酸的含量为 6.98mg/g, 儿茶素的含量为 2.64mg/g,表儿茶素的含量为17.84mg/g,原花青素B1的含量为4.07mg/g,原花青素B2的含量为8.43mg/g在此基础上 ,我们建立了同时测定小鼠生物样品中儿茶素 , 表儿茶素 , 原花青 素B1,原花青素B2的LC-MS/M鲂析方法,并进行专属性、线性、回收率、准确 度、精密度的考察。采用DSS诱

4、导渍疡性结肠炎小鼠模型，正常小鼠及溃疡性结 肠炎小鼠分别给予金荞麦提取物 (2.28g/kg), 于不同时间点取血浆、 肝脏、空肠、 结肠。结果表明儿茶素、原花青素B1和原花青素B2在溃疡性结肠炎小鼠中的系统 暴露程度均有所增加。 组织分布结果显示金荞麦中主要活性成分儿茶素、 表儿茶 素、原花青素B1和原花青素B2在溃疡性结肠炎小鼠的肝脏组织、空肠、结肠组织中的浓度较正常组高。提示在病理状态下 , 这些成分的高浓度分布 , 可以有效的保证其效应的发挥。第二部分研究中,我们采用TNBS诱导小鼠结肠炎,使用不同剂量的Fag提取物 (0.57,1.14,2.28g/kg) 和柳氮磺吡啶 (SASP,

5、200mg/kg), 观察体重变化,结肠长度, 对结肠组织H&E染色并病理学评分,测定炎症细胞浸润情况(F4/80标记阳性),测 定结肠髓过氧化物酶(MPO活舌性,血浆中的LPS和促炎细胞因子水平,以及促炎细 胞因子mRN/在结肠中表达情况。结果表明金养麦提取物可显著改善由 TNBS诱导的小鼠体重减轻、结肠缩短， 降低结肠病理评分及MPO舌性。同时金养麦提取物可显著抑制 TNBS引起的小鼠 结肠组织中IL-6,IL-1 B和TNF-a的mRNA表达，降低溃疡性结肠炎小鼠血浆中 的LPS, IL-6, IL-1B和TNF-a ,进而发挥其抗炎效应。第三部分内容中,我们采用DSS诱导溃疡性

6、结肠炎,使用不同剂量的Fag提取 物和柳氮磺吡啶,观察小鼠体重变化,结肠长度,结肠组织H&E染色,测定结肠髓 过氧化物酶(MPO舌性,促炎细胞因子mRN/在结肠中表达情况、结肠组织中紧密连接蛋白Z0-1,0ccluidn表达,以FD4为底物研究其胃肠道通透性,血浆中的LPSIL-6、TNF-a和IL-10水平,并对其结肠组织中NF-k B的表达进行研究。结果表 明金养麦提取物可显著改善由 DSS 诱导的小鼠体重减轻、结肠缩短，降低结肠病 理评分及MPO舌性。同时金养麦提取物可显著抑制 DSS引起的小鼠结肠组织中IL-6和TNF-a的 mRN表达,增加IL-10的mRN在结肠组织中的表达

7、,抑制结肠组织中NF-k B表 达，降低DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠血浆中LPS IL-6和TNF-a的浓度。此外 金养麦提取物还可以显著降低由 DSS诱导的肠黏膜屏障功能损伤，并增加紧密连 接蛋白 Z0-1 和 occludin 在结肠组织中的表达。为初步研究金养麦的抗炎机制，在第四部分研究中我们采用LPS分别刺激 RAW264.7细胞,THP-1细胞,研究金养麦提取物(5,10,20,50卩g/mL)对IL-6和 TNF-a分泌的影响、Cox-2和iNOS的表达、NF-k B核易位情况及对核苷酸结合 寡聚化结构域样受体 3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor3, NLRP3) 信号通路的影响。结果表明金养麦提取物可剂量依赖性的降 低IL-6和TNF-a的分泌，抑制由LPS诱导的Cox-2和iNOS表达上调，同时金养 麦提取物可显著抑制NF-k B的核易位，可能与其抑制I k B磷酸化有关。此外在 THP-1 细胞中 , 我们发现 , 金养麦提取物可以显著抑制 CleavedCaspase-1, IL-1 B , NLRP3和 ASC的相对蛋白表达量，从而发挥其抗炎作用。结 论和意义 本研究通过体内和体外实验两个方面证实 ,Fag 可显著改善溃疡性结 肠炎引起的肠黏膜屏障功能损伤、抑制结肠组织中炎症