幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

1、时间：2021年3月29日学海无涯页码：第1页共6页幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp尾一种定植于人类胃黏膜的革兰染色阴性、螺旋状、微需氧菌，是慢性胃炎、消化性溃疡的病原体， 也与胃腺癌及黏膜相关性淋巴瘤的发生密切相关1-4o全世界范 围内Hp的感染率超过50%5。Hp是一种对氧敏感的微需氧菌，菌体 内还 有多种抗氧化蛋口，其中烷基过氧化氢物还原酶（Ahp）最为丰富，其作用是通过在高氧化环境中还原有毒的氢化氧化物来实现的。Ahp由ahpC基因编码，是抗氧化酶家族peroxiredoxins（prxs）的成员之一 。木研究利用基因克隆

2、技术，将编码Hp ahpC外膜蛋白的基因经 PCRT增后，构建重组载体，并在 E.coli BL21（DE3卢进行表达和纯化，为进 一步研究奠定基础。1材料与方法1.1 材料幽门螺杆菌中国分离株 MEL-Hp27简称Hp27）及质粒pET-30a 由木实验室培养和保存；柱、大肠杆菌 DH5a BL21 （DE3）tJ自创 生 公司；限制性核酸内切酶 Nde I和Xho卜pMD18-T VectorProtein marker T4 DNA1接酶均贝自大连 TaKaR赤司；Taq DNA聚合酶、dNTP DNA marker.细菌基因组DNA抽提试剂盒、DNA电泳胶回收、质粒抽提试剂盒购自天根生

3、化科技（北京）有限公司。引物合成由北京 赛百盛生 物工程公司完成，DNA测序由北京三博远志生物有限责任公司完成。其他试剂均为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 Hp基因组DNA的提取刮取经3d培养的Hp培养板上的Hp,以12000r/min离心 lmin,取沉淀按细菌基因组抽提试剂盒操作方法提取Hp DNAo1.2.2 AhpC编码基因的扩增根据GenBank上公布的Hp ahpC基因序列，利用引物设计软 件primer5.0设计ahpC基因的引物P1和P2。P1的序列为：5'- CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3U 线为 Nde I 酶切位点；P2 的 序歹 U

4、 为：5'-CGCTCGAGAAGCTTAATGGAATTT3 戈 U 线为 XhoI 酶切位 点°以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板，P1和P2为弓I 物进行PCR扩增。反应条件为：94预变性5min,然后94°C变性30s, 60 °C退火30s, 72 C°延伸60s共循环35次，最后于72 °C延伸5min。 PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，观察扩增结果并用凝胶回收 试剂盒回收PCRJT增产物。1.2.3 重组载体的构建 回收的PCR产物与pMDl8-T按照载体与插入DNA的摩尔比 为1 : 6的比例混

5、合后，置26连接过夜，体系为PMD18-T载体1 UL、PORT物2UL、双蒸水2UL、连接液5 U L经蓝白斑筛选鉴定的 pMD18T-ahpC和表达载体 pET-30a用Nde I和Xho I双酶切，以10g/L 琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收后，用T4DNA连接酶于22°C进行连接，pET-30a片段与插入DNA的摩尔比为1 : (1? 3)。连接后的重组表 达 载体pET30a-ahpCM经Nde I和Xho I双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶 电泳鉴定。1.2.4 重组质粒的转化将重组载体pET3Oa-ahpC专化感受态大肠杆菌BL21(DE3)构 建的重组工程菌涂布含卡那霉素的

6、LB琼脂培养基，37培养12?16h,挑选单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，置37O摇床振荡培养12ho抽提质粒，以Nde I和Xho I双酶切后，10g/L琼脂 糖凝胶电泳鉴定，DNA碱基序列测定由北京三博志远生物有限责任 公司完成。1.2.5 重组载体在 E.coli中的表达取经酶切鉴定构建成功的重组工程菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37O摇床培养至A600达到0.5时，加入终浓度为 0.3mmol/L的IPTG诱导，于诱导过程中取样，同时作空载体菌对照， 采用SDS-PAGlfe泳分析重组AhpC的表达。优化诱导表达条件，用UVP 凝胶成像系统分析重组蛋口的相对含量。1.

7、2.6表达纯化rAhpC蛋白将大量诱导的细菌4C 4000g离心收集细菌，PBS洗菌1次， 重悬于纯水中，-20 C过夜后超声破碎，12000g离心，收集上清及沉淀。使用离子亲和层析柱纯化融合蛋白，SDS-PAG由泳检查蛋白纯化效果。2结果2.1 Hp ahpC编码基因的扩增以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板进行PCR扩 增，所获PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，在600bp 附近有单一条带，片段的大小与预计相符（图 l） o2.2 重组载体的酶切鉴定科技论文发表网站回收幽门螺杆菌QhpC基因的PCR产物，与pMD18-T连接后 转化感受态DH5a受体菌，经蓝

8、口斑筛选试验挑取口色菌斑扩增培养 后，提取pMD18T-ahpC质粒。经限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切 切 出约600bp片段，回收后与用同样限制性内切酶双酶切的表达载体 pET-30a连接，获得阳性重组质粒，命名为pET30a-ahpCo重组质粒双酶切鉴定得到1条约594bp的带，与实验设计相一致（图 2）,第3泳 道出现第3条带，可能是因为双酶切时间为10h,酶切时间过长产生 的 非特异条带，但对实验结果无影响。2.3 ahpC基因序列的分析ahpC基因的测序结果见图3。ahpC的碱基测序结果与GenBank己公布的Hp菌株编码ahpC基因的序列进行同源性比对，其 一致性达99%

9、（ 590方94），其编码的氨基酸序列同源性为 99%（ 19A198） o 2.4重组载体在E.coli中的表达及表达形式鉴定重组质粒pET30a-ahpC专化至E.coli BL21 （DE3）中获得重组工 程菌，接种LB液体培养基，于37°C培养至A600达到0.5时，力口入终 浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导4h,收集菌体进行SDS-PAG检测。可见在Mr 23ku处出现1条新的蛋白带，与理论预测值相符（图4）。2.5 重组表达蛋口 rAhpC的纯化可溶性分析目的蛋口主要以可溶性方式存在。 选取镰离子亲 和层析柱纯化蛋白，收集洗脱液，SDS-PAG盅泳检测洗脱液目的蛋

10、口 的分子大小。经UVP凝胶成像系统分析，洗脱所得目的蛋口的分 子 质量为23ku （图5） o3讨论科技论文发表网站大多数细胞都具有产生和清除活性氧（ROS的能力。在正常情况 下，活性氧是作为分子氧单电子还原反应的不可避免的产物。正常细胞具有相关的保护机制维持细胞内最低水平的活性氧浓度。而过 氧化氢是一种稳定的活性氧分子，能够穿过细胞膜并且在多种细胞 的生理 过程中起着重要的作用，包括蛋白磷酸化、基因表达、转录因 子的活化、DNA合成和细胞分裂等过程。高浓度过氧化氢对细胞具 有毒性，尤其是能够对细胞组分造成损伤；而适当浓度的过氧化氢可 以作为第2信使分子参与信号传导途径并调节细胞代谢。而黄单胞菌 中，Ahp和CAT （过氧化氢酶）等共同调控细胞内过氧化氢的水平， ahpC突变能引起细胞内过氧化氢水平下降7。黄志刚等利用同源重组技术构 建了 Hp27基因敲除突变株（Hp27AcagA），并利用蛋白 质组学技术进行差异蛋白质的研究，发现 Ahp在cagA基因敲除突变株菌体蛋口中 表达下降，可能影响Hp的抗氧化应急能力。本研究对 编码Hp小分子外膜蛋白ahpC的基因进行克隆，并进行序列测定， 所得序列与GenBank公布的序列一致性为99% ;成功构建重组表达载 体pET30a-ahpCg过双酶切及测序鉴定，结果与预测一致；经42&#