实体瘤组织单细胞悬液制备

1、实体瘤组织单细胞悬液制备及培养方案一、 单细胞悬液制备（ 一 ）仪器、材料及试剂1. 仪器：（1）CO 2培养箱（调至37C）,离心机，水浴锅（37C）,血球计数板；（2）无菌器械：细胞培养瓶， 50 ml 离心管，平皿，吸管，移液管，纱布， 200 目/ 300 目尼龙滤网，手术器械。2. 材料：肿瘤造模成功的大鼠3. 试剂：RPMI1640培养基（含10%、牛血清），0.25%胰酶，Hank's液/PBS缓冲 液，碘酒附： Hank's 液配方：KH2PO4 ： 0.06g； NaCl： 8.0g； NaHCO3： 0.35g； KCl： 0.4g ；Glucose : 1

2、.0g ; Na2HPQH2O 0.06g ;加HQ定容至1000 ml注：Hank's液可以高压灭菌，4C下保存。（ 二 ）操作步骤机械- 胰酶消化法1. 取材： 制备实体瘤单细胞悬液， 肿瘤取材部位非常重要， 体积较大的肿瘤组织 中有退变或坏死区， 取材时尽量避免用退变组织， 挑选活力较好的部位。 将大 鼠麻醉，置 75%酒精泡 3-5 min （时间不能过长，以免酒精从口和肛门浸入体 内），固定后再用碘酒消毒腹部， 带入超净台内解剖取肿瘤组织， 置于平皿中。2. 用Hank's液/PBS缓冲液洗涤三次，并剔除周围脂肪、结缔组织、血液等。3. 用无菌眼科手术剪将肿瘤剪成小块

3、（1-2 mm）,再用Hank's液/PBS缓冲液洗涤三次，转移至 50 ml 离心管中。4. 视组织块量加入 5-6倍的0.25%胰酶液，37C中消化20-40 min，每隔5 min 轻轻振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。5. 加入 2-5 ml 含血清培养基，以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。6. 静置 2-3 min ，使未分散的组织块下沉，将悬液转移到新的离心管中。7. 用 200/300 目尼龙网过滤悬液 2 次。8. 将过滤后悬液 1000 rpm ，离心 5-10 min ，弃上清液。9. 加入Hank's液/PBS缓冲液5 ml，轻轻冲散细胞，再离

4、心一次，弃上清液。10. 视细胞量加入 l-2 ml 培养液，血球计数板计数。11将细胞调整到5X105 /ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37C下培养。或 者直接用作流式分析及其他分析。二、 实体瘤组织中抗癌药物含量检测1. 按上述取材步骤取出合适的肿瘤组织，分成A、B两份，分别置于含有 1-2 ml PBS 缓冲液的无菌离心管中（离心管及 PBS 液已称重），准确称量肿瘤组织的重量。 A 组可直接用于检测组织中抗癌药物的含量， B 组用于检测细胞内抗癌药物含量。2. B组组织按照上述步骤制成单细胞悬液，制备过程中，保留每一次的PBS洗液（1-2ml）,标记清楚，用于检查含药量。3.

5、 将单细胞悬液计数，统计细胞总量，检查细胞内抗癌药物含量。肿瘤细胞培养（ 一 ） 肿瘤细胞培养1. 肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格,一般常用的RPMIl640 、 DMEM、等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞多为贴壁细胞,将刚分散的细胞转移至培养瓶后,待 4-5 h 后观察细 胞贴壁情况,此时可更换新的培养基,除去未能贴壁的细胞碎片及死细胞。2. 每日观察细胞生长增殖情况,待细胞贴壁密度大于90%时,可用胰酶消化,按1:5 比例进行传代到新的培养瓶或培养板上,可根据需要适当调整接种比例, 或者取适量消化后进行其他细胞实验。（二）成纤维细胞的排除成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长,

6、 致难以纯化肿瘤细胞。 而且成纤维细胞常 比肿瘤细胞生长得快, 最终能压制肿瘤细胞的生长。 因此排除成纤维细胞成为肿瘤 细胞培养中的关键。1. 机械刮除法： 是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头 （用胶塞剪成三角形插以不锈钢 丝）、或裹少许脱脂棉制成,装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧 灼器刮除） 。刮除程序为：1）标记：镜下观察,用记号笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；2）刮除：弃掉培养液, 把无菌胶刮伸入瓶皿中, 肉眼或显微镜窥视下,刮除 无标记空间；3）用Hanks液/PBS缓冲液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；4）注入培养液继续培养, 如发现仍有成纤维细胞残留, 可重复刮除至完全

7、除 掉为止2. 反复贴壁法： 根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点, 并结合使用不加 血清的营养液,把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁,使两类细胞相互分离, 操作方法与传代相同。1）待细胞生长达一定数量后,倒出旧培养液,用胰酶消化后,Hanks /PBS缓冲液冲洗 2 次,加入不含血清的培养液,吹打制成细胞悬液；2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入 A培养瓶中。置温箱 中静止培养520分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出 全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温 箱中继续培养；3）培养B瓶中细胞520分钟后，接处理A的方法，把培养液注入 C

8、培养瓶 中；再向 B 瓶中补加完全培养基。4）当三个瓶内都含有培养液后, 均在温箱中继续培养。 如操作成功, 次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。3. 消化排除法：1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02 % EDTA（ 1:1）混合液漂洗培养细胞一次， 然后再换成新的混合液继续消化， 并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养 瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；2）把消化液吸入离心管中， 离心去上清， 吸入另瓶中， 加培养液置温箱中培 养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。 用此法处理后， 成纤维细胞比 肿瘤细胞易先

9、脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。4. 胶原酶消化法: 本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。1）可用 0.5 mg/ml 的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发 现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；2）用 Hanks/PBS 缓冲液洗涤处理一次后， 更换新培养液， 继续培养， 可获纯 净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。四、 注意事项（ 一 ） 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。（二）在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。（三）凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。四、 无菌操作的几个注意事项（一） 操作前要洗手， 进入超净台后手要用 75%酒精或 0.2%新洁尔灭擦拭。 试剂等瓶口也 要擦拭。（二）点燃酒精灯， 操作在火焰附近进行， 耐热物品要经常在火焰上烧灼， 金属器械烧灼 时间不能太长， 以免退火， 并冷却后才能夹取组织， 吸取过营养液的用具