用IgHTCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变

1、用IgH、TCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变 作者：钟梅, 吕亚莉, 李冰, 赵坡【摘要】 目的 探讨IgH 、TCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变的意义。方法 采用IgH、TCR、TCR基因重排标志检测，36例经常规HE、免疫组化不能诊断的疑难淋巴组织增生性病变，并进行克隆性分析。结果 29例淋巴组织增生性病变呈克隆阳性，其中IgH、TCR双重排阳性者为13例，IgH单一阳性8例，TCR单阳性为8例。克隆阳性病例与免疫组化结果一致的为24/29例，7例阴性者，4例为反应性增生，2例经随诊为猫抓病淋巴结炎，1例为不典型增生。结论 IgH、TCR基因重排技术对于疑难淋巴组织增生

2、性病变的诊断和鉴别诊断有较大的意义。 【关键词】 淋巴瘤基因重排;诊断Detecting Problematic Proliferative Lesions of Lymph Tissue by IgH and TCR Gene Rearrangement TechniqueAbstract：Objective To investigate the significance in diagnosis of problematic proliferative lesions of lymph tissue by IgH, TCR gene rearrangement technique.Meth

3、ods Thirtysix cases of proliferative lesions of lymph tissue with diagnostic difficulty by routine HE and immunohistochemistry, were analyzed in detail by PCRbased IgH, TCR gene rearrangement technique to further determine the diagnosis. 20 cases of previously diagnosed lymphoma and 10 reactive lymp

4、hadenitis were used as a positive control and negative control, respectively.Results All control samples of lymphoma were positive for clonal rearrangement. 29/36(80.6%)cases of problematic lesion showed positive for clonal proliferation in which those positive for both IgH and TCR were 13/29(44.8%)

5、, for single, IgH 8/29(27.6%)or TCR 8/29(27.6%), respectively; and those positivity associated with immunohistochemistry were 24/29(82.8%). In seven cases negative for clonal rearrangement, 4 were reactive proliferation，2 Cat scratch lymphadenitis and 1 atypical proliferation.Conclusion It is signif

6、icantly useful to solve the problems in differentiating diagnosis of elusive proliferative lesions of lymph tissue, by IgH, TCR gene rearrangement analysis.Key words：Lymphoma; Gene rearrangement; Diagnosis0 引言 本研究应用IgH、TCR、TCR基因重排技术对36例疑难淋巴组织增生性病变进行分析，以探讨实际工作中解决疑难问题的可能性及意义。1 材料与方法11 材料 收集2000年1月2004

7、年5月解放军总医院及外院临床初诊为淋巴瘤的淋巴组织增生的活检标本36例，经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，HE染色常规免疫组化CD20、CD3、CD43、CD79a等仍不能肯定诊断。其中淋巴结为13例，结外病变为23例，男21例、女15例，年龄为1488岁，中位年龄为48岁。同时取10例淋巴结反应性增生作为阴性对照，20例既往肯定诊断的淋巴瘤为阳性对照。12 方法1.2.1 DNA提取 36例经组织学和免疫组化诊断的福尔马林固定、石蜡包埋的淋巴瘤组织，切取46片5m的淋巴瘤蜡块组织，置于1.5ml小离心管内，用二甲苯脱蜡3次后，无水酒精去二甲苯，在含蛋白酶K的裂解液中55消化1h。煮沸灭活蛋白酶

8、K，并离心，取上清2l直接用于PCR。1.2.2 PCR引物及扩增 FR3 IgH 1 :引物I 5CTGTCGACACGGCCGTGTATTACTG3 , 引物 5AACTGCAGAGGAGACGGTGACC3,产物为100120bp。TCR2： 引物I 5TCATGGTGTAACATTGTGGGGAC3(D2)，引物 5AGCACCGTGAGCCTGGTGCC3 （J2），产物为5586bp。TCR3:引物 5TACATCCACTGGTCCTACACCA3,引物 5CCCGTCGACTACCTTGGAAATGTTGTATTCTTC3。DNA扩增体系为25l，10×PCR缓冲液25

9、l，dNTP2l，热启动TaqDNA聚合酶1，MgCl2浓度1.5mM，模板DNA2l。95 5min后，94变性30秒，55退火30秒，72延伸30秒，共35个循环后，72延伸7min。1.3 结果判定 IgH、TCR基因克隆性重排阳性为一清晰的电泳带,IgH大小为100120bp、TCR为5586bp、TCR为300bp，电泳条带模糊或多条带均判断为阴性。2 结果21 IgH、TCR克隆性重排 36例疑难或交界淋巴组织增生性病变中，IgH、TCR克隆重排阳性为29/36（80.6%），阴性为7/36（19.4%）,其中IgH、TCR双重排阳性者为13/29，IgH单阳性8/29例、TCR单

10、阳性为8/29例,见图1。20例阳性对照均为阳性，10例阴性对照均为阴性。图1 IgH、TCR克隆性重排电泳图 （略）1为PBR322 DNA/Hae Marker片段,25为淋巴瘤TCR扩增阳性,6、8、9为淋巴瘤IgH扩增阳性22 IgH、TCR克隆性重排分析 本组阳性病例中与免疫组化结果一致的有24/29。当IgH、TCR双重排时，其免疫组化亦表达CD20、CD79a或CD3、CD43。原有5例虽考虑但不能下决心诊断的何杰金氏淋巴瘤病例，4/5例克隆重排阳性，其中IgH、TCR均克隆重排阳性者1例，IgH阳性者3例，已确诊。纠正以往未明确分类的淋巴瘤5例，3例为T细胞瘤，2例为B细胞瘤。

11、7例阴性者，4例为反应性增生，2例经随访为猫抓病淋巴结炎，1例为不典型增生，建议密切随诊。3 讨论 IgH、TCR基因重排技术是检测淋巴细胞克隆性增生的金标准，应用于恶性淋巴瘤的早期诊断和鉴别诊断有重大意义，特别是对于经常规HE、免疫组化检测仍不能确诊的病例有较好的用途和前景。国内外对基因重排技术虽研究较早，但临床病理目前仍应用较少，经验也不足，尤其是对于早期淋巴瘤的诊断尚需进一步积累。本研究显示：（1）对早期淋巴瘤的诊断：某些早期淋巴瘤在免疫组化上表达为T、B细胞标记均阳性，本研究中有12/29例属于T、B免疫标记均阳性，基因分析表现为TCR、IgH双重排阳性，可能为TCR与IgH基因同属于

12、Ig基因超家族，二者的序列识别非常相似，由于在恶性干细胞分化的早期，重排过程缺乏精确性以至发生错误。另一种看法认为双重排是恶性干细胞的异常表达所致，说明恶性克隆的分化不稳定3，我们认为最后诊断应结合临床、免疫组化和基因重排的结果进一步分类。（2）对何杰金氏淋巴瘤的确定诊断。本组5例原考虑为何杰金氏淋巴瘤，但CD15（-），CD20、CD3均部分阳性的样本中，4例为IgH克隆阳性，其中1例TCR、IgH均为阳性，最后均确定诊断为何杰金氏淋巴瘤。（3）与猫抓病淋巴结反应性增生的鉴别，本组2例猫抓病免疫组化T（+）；CD68（+），特别是T细胞增生活跃，出现异形性，但基因重排结果显示TCR为阴性，符

13、合多克隆性增生；追问病史有养猫、犬史，避免了过渡诊断。我们认为对于常规HE、免疫组化结果难以诊断的淋巴组织增生性病变应进一步检测其克隆性，有助于避免传统病理学诊断中的漏诊、过诊以及误诊，值得在全国大、中型医院临床病理诊断工作中进一步推广应用。【参考文献】 1 McCarthy KP, Sloane JP, Kabarowski JHS, et al. A simplified method of detection of clonal rearrangements of the Tcell receptor chain geneJ. Diagn Mol Pathol，1992，1(3):173179. 2 Achille A, Scarpa A, Montresor M, et al. Routine