脾脏淋巴细胞分离方法

1、小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml, 1XPBS溶液，hanks液40ml。红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器 5-10ml, 15ml、50ml离心管，4mlEP管，离心机等。1、配制的 percoll工作液： 配制 15 ml原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。100%percoll 液(简称工作液):13.5ml percoll 2、配制6个梯度，每个梯度 2ml,实际配制3ml3 / 370%percoll 液(1.090g/ml60%

2、percoll 液(1.077g/ml50%percoll 液(1.067g/ml40%percoll 液(1.050g/ml30%percoll 液(1.043g/ml20%percoll 液(1.031g/ml):2.1 ml 工作液 +0.9 ml):1.8 ml 工作液 +1.2 ml):1.5 ml 工作液 +1.5 ml):1.2 ml 工作液 +1.8 ml):0.9 ml 工作液 +2.1 ml):0.6 ml 工作液 +2.4 ml0.85%Nacl溶液混匀备用0.85%Nacl溶液混匀备用0.85%Nacl溶液混匀备用0.85%Nacl溶液混匀备用0.85%Nacl溶液混匀

3、备用0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高(20% percoll液-70%percoll液)依次装入，装好备用。3、小鼠脾脏细胞分离(1)颈椎脱臼处死小鼠。75%酒精浸泡10min(2)无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks'液中，将脾脏放入 2ml离心管中剪碎。(3)将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks'液冲洗。(4)收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min ,弃上清。(5)加10ml ?红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min ,再1500rpm 10min(6)洗三遍，1500rpm 5min

4、 ,离心去上清(7)加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。(8)用注射器缓慢沿着事先准备好的梯度分离管中，水平离心1800-2000rpm 30-40min(9)收集想要的分层，用 1xPBS洗3遍(10)用完全RPMI-1640培养基混悬沉淀，(调成浓度为1X108/ml的细胞悬液)转入培养皿中，置37 C, 5%CO2下孵育30min后(去除贴壁的细胞)，收获未贴壁细胞注：贴壁为单核细胞(巨噬细胞，树突细胞)不贴壁的悬浮细胞(T/B/NK细胞)附件1:表 人不同血细胞的漂浮密度细 胞浮浮密度I细 胞漂浮密度1 052*1 0771 062-1 0751 065-1 0771.065-

5、1 0771.050-1 070红细胞1-09-1.11|淋巴细胞粒细胞| B淋巴细胞嗜酸性1-09-1 095| T汨巴细胞嗜中性L060-1 085|淋巴母细胞单核细胞1.0501 口66|自然杀伤细胞血小板 1.030-1 060（一）原理Percoll是一种包有乙烯口比咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低（20mosm /kg H 2 O）,粘度也很小，可形成高达1.3g /ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力（2001000g）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于 Percoll扩散常数低，所形成的梯度十 分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用

6、于分离细胞、亚细胞成 分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。（二）操作方法及注意事项1 .不同浓度（密度）Percoll溶液的制备：先用9份Percoll与1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85 % NaCl或0.15M PBS）稀释到所需浓度。Percoll 浓度（%）706050403020比重 g/ ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.0312 .不连续密度梯度 Percoll层的制备：先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预 处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满

7、意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。3 .装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度 也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。4 .离心：一般采用离心力为 400g ,时间2025min。由于多层Percoll之间密度差别 不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。5 .取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于 Percoll层中，则需要逐层收集。收获

8、含有Percoll液的 细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。（三）分离纯化细胞举例1 .富含NK活性大颗粒淋巴细胞（LGL）的纯化：按顺序由下向上逐层加 50%、47.5%、 45%、42.5 %和40%五种不同密度的 Percoll，如用10ml试管（或塑料管）分离，每层Percoll 约1.21.5ml,初步从外周血中分离的 PBMC细胞1X108悬于1 ml培基中，按要求装样、 离心和取样。一般富含 NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5 %与45 % Percoll界面以及上下 二层的Percoll液中。2 .纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50%和30% Percoll液。收取经PHA（或其它抗原、有丝分裂原）刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC（如肾综合征出血热患者）,按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层 Percoll之间为淋巴母 细胞，纯度