遗传疾病的诊断-FudanUniversity

1、第十八章遗传病的诊断遗传病诊断是一项复杂的工作，需要多学科的密切配合。遗传病 的诊断包括常规诊断和特殊诊断。常规诊断指与一般疾病相同的诊断 方法，特殊诊断是指采用遗传学方法，包括染色体检查，家系分析等, 是遗传病确诊的关键。目前，临床上遗传病诊断包括：临症诊断、症 状前诊断 （presymptomatic diagnosis、出生前诊断和植入前诊断。第一节临症诊断临症诊断（symptomatic diagnosis是根据患者的各种临床表现进 行分析，确诊并判断遗传方式，是遗传病诊断的主要内容。一、病史、症状和体征（一）病史遗传病大多有家族聚集倾向，因此病史的采集非常重要。在采集 病史时要准确、

2、详尽。另外还要收集病人的家族史、婚姻史和生育史 等相关信息。遗传病史的采集比其他疾病更重要，因为遗传病的家族 聚集性和其传递的规律性决定了病史采集可能会获得更有用的信息， 对后续的分析工作可能会有很大的帮助。病史采集的关键是材料的真 实性和完整性。病史采集，主要是通过采集对象的描述和有关个体的 病案查询工作来完成。实践中还应注意不同个体描述是否可以相互印 证，以确定资料的可信度。对于发病原因、过程、时间、地点、治疗 情况等也应详细记录。（二）症状与体症遗传病除了具有其他疾病相同的体征外，还有特异性 征候群，这 些都为初步诊断提供线索。大多遗传病在婴儿和儿童期有相应的体征和症状，如Down 综合

3、征患儿的特殊面容和智力低下等，当然还需要通过染色体检查进一步确诊。二、家系分析根据对患者及家族成员发病情况的调查结果绘制系谱，确定单基因病或多基因病，遗传方式等。系谱分析时应注意：系谱的完整性和准确性；单基因遗传病的分析非常有用，常染色体显性遗传病、常染色体隐性遗传病，X 连锁显性遗传病，X 连锁隐性遗传病，Y 连锁遗传病。单基因遗传分析中要注意外显不全，延迟显性，显、隐性的相对性， 新的突变产生，遗传印记，动态突变，以及遗传异质性等问题，避免判断上的错误和发病风险的错误估计。线粒体遗传病通过母系遗传，主要特点是晚发，进行性。多基因病是一大类常见的疾病，有家族聚集倾向，但不遵循孟德尔分离规律。

4、以往被认为是多基因病的一些疾病，一部分被证明是遗传异质性所致， 即受单个主基因决定，如癫痫， 先天性心脏病和先天性巨结肠等。三、细胞遗传学检查细胞遗传学检查染色体检查或核型分析，是辅助诊断和对染色体病确诊的主要方法。随着显带技术的应用，特别是高分辨染色体显带技术的发展，能够更准确地发现和确定更多的染色体数目和结构异常，并发现新的微小畸变综合征。利用染色体显带技术，可以对许多疾病在染色体水平找到原发性改变，如肿瘤，发育缺陷、心血管疾病等，把疾病相关基因确定在一个较小的范围内。染色体原位杂交是应用标记的DNA 片段（探针）与玻片标本上的细胞、 染色体， 以及间期的DNA 或 RNA 杂交， 研究核

5、酸片段的位置、相互关系的技术。一般用生物素、地高辛等标记探针，原位杂交后，用荧光染料标记的生物素亲和蛋白、抗亲和蛋白的抗体进行免疫检测和杂交信号放大，使探针杂交的区域发出荧光，这种原位杂交称荧光原位杂交（FISH）,灵敏度高，特异性强，可以检测染色体微小 结构异常，也可应用在基因定位和基因制图等领域。另外还有双色 FISH、多色FISH和染色体涂染等方法，大大提高了染色体畸变的检 出率和准确性。染色体检查标本主要有外周血，羊水中胎儿脱落细胞和胎儿的脐 带血，病人的骨髓、胸腹水、手术切除的病理组织，培养细胞等。染色体检查适应症包括：明显智力发育不全者；生长迟缓或伴有 其他先天畸形者；夫妻之一有染

6、色体异常，如平衡异位，嵌合体等； 家族中已有染色体异常或先天畸形的个体；多发性流产妇女及其丈 夫；原发性闭经和女性不育症；无精子症和不育的男性；两性畸形者; 疑为先天愚型的患儿及其父母；原因不明的智力低下并伴有大耳、大 睾丸和多动症者；35岁以上的高龄孕妇。四、生化检查生化检查是遗传病诊断的重要辅助手段，主要是对由于基因突变 所引起的酶和蛋白质的定量和定性分析，对单基因病和先天性代谢病 进行诊断，包括一般的临床生化检验和针对遗传病的特异检查。目前已知的多种遗传性代谢病中，大多数为酶缺陷。可由于基因 突变、基因缺失、基因表达异常或翻译后加工修饰缺陷所致。目前临 床主要对酶活性和代谢产物进行检测，

7、以血液和尿液为主要检材，有 的可以制成滤纸片和通过显色反应进行检测，随着对遗传病发病机理 认识的深入和检测方法的改进，检测将更加简便、快捷。第二节出生前诊断出生前诊断或称产前诊断 （prenatal diagnosis是采用羊膜穿刺术 或绒毛取样等技术，对羊水、羊水细胞和绒毛进行遗传学检验，对胎 儿的染色体、基因进行分析诊断，是预防遗传病患儿出生的有效手段，越来越广泛的被应用一、出生前诊断对象根据遗传病的危害程度和发病率，可将出生前诊断的对象排列如 下：夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或者夫妇染 色体正常，但生育过染色体病患儿的孕妇；35岁以上的孕妇；夫 妇之一有开放性神经管畸形，

8、或生育过这种畸形患儿的孕妇；夫妇 之一有先天性代谢缺陷，或生育过这种患儿的孕妇； X连锁遗传病 致病基因携带者孕妇；有习惯性流产史的孕妇；羊水过多的孕妇； 夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇；有遗传病家族史，又系近亲 结婚的孕妇。但应当注意，已出现先兆流产、妊娠时间过长、有出血 倾向者的孕妇不宜做产前诊断。二、出生前诊断的方法（一）B 超B超是一种安全无创的检测方法，能够详细检查胎儿的外部形态 和内部结构，使许多遗传性疾病得到早期诊断。可以诊断的疾病有， 神经管缺陷、脑积水、无脑畸形；唇裂、腭裂，颈部淋巴管肿瘤；先 天性心脏病，支气管、肺发育异常、胸腔积液；其他的异常，如先天 性单侧肾缺如，先天性

9、幽门狭窄、先天性巨结肠等。（二）羊膜穿刺羊膜穿刺是在B超的监视下，用消毒的注射器抽取胎儿羊水（图 18-1）。可以对抽取的羊水及其中的胎儿脱落细胞进行细胞培养，分析染色体，以及生化和基因的检测。如羊水中甲胎蛋白浓度过高时，提 示胎儿可能有无脑、开放性脊柱裂、脊髓脊膜膨出和脑积水等异常。 羊膜穿刺一般在妊娠1620周进行，流产的风险相对较小。图18-1羊膜穿刺示意图（三）绒毛取样法绒毛取样一般在妊娠79周进行，是妊娠早期诊断方法。也是 在B超监视下，用特制的取样器，从阴道经宫颈进入子宫，沿子宫壁 到达取样部位，用内管吸取绒毛（图 18-2）。绒毛取样的优点是检查 时间早，需要作出选择性流产时，给

10、孕妇带来的损伤和痛苦较小。缺 点是经子宫颈取样标本容易被污染，胎儿和母体感染和操作不便，引 起流产的风险是羊膜穿刺的两倍。羊膜穿刺法和绒毛取样可用来诊断染色体病，遗传代谢病，胎儿 性别鉴定，所有可用胚胎或胎儿 DNA检测的疾病，另外，开放性神 经管缺陷只能采用羊膜穿刺术诊断。图18-2绒毛取样法示意图（四）脐带穿刺术脐带穿刺术是在B超的监视下，用细针经腹壁、子宫进入胎儿脐 带抽取胎儿血液。本方法取样最好在妊娠 18周，常用于因错过绒毛 取样或羊膜穿刺最佳时机或羊水检查失败的补救措施，还可以检测胎 儿的血液系统疾病，先天性免疫缺陷，某些单基因病。（五）胎儿镜检查又称羊膜腔镜或宫腔镜检查，它可在进

11、入羊膜腔后，直接观察胎 儿的外形、性别和发育状况，是否有畸形，还可以同时抽取羊水或胎 血进行检查，或进行宫内治疗。因此，理论上这是一种最理想的方法。 但由于操作困难，容易引起多种并发症，目前还不能被广泛采用。胎 儿镜检查的最佳时间是妊娠 1820周，可以诊断大疱性表皮松懈症 及某些皮肤病。（六）分离孕妇外周血中的胎儿细胞目前用于出生前诊断材料的获得对于胎儿和母体都是创伤性的， 存在流产和感染等风险。从20世纪90年代末，开始探索一种无创伤 性的出生前诊断方法。利用妊娠期少量胎儿细胞可以通过胎盘进入母 体血液中，采用流式细胞仪分离技术，磁激活细胞分选技术，免疫磁 珠法，显微操作分选法，分离胎儿细

12、胞。用这些方法富集的胎儿细胞 很少，需要用高灵敏的技术方法进行下一步分析检测，目前常用的方 法是PCR。（七）植入前诊断随着人工受精，试管婴儿和胚胎移植技术的开展，以及单个细胞 基因诊断技术的应用，目前正探索在胚胎植入前诊断（pre-implantation diagnosis。在受精后6天胚胎着床前，通过显微操作技术取出一个 细胞，应用PCR, FISH等技术进行特定基因和染色体畸变的检测， 将人类的遗传缺陷掌控在最早阶段，这是遗传病产前诊断的重大突 破。Indications for Prenatal Diagnosis1 .Advanced maternal age (often at

13、least 35 years at the expected date of confinement): If there is no previous history of a chromosome abnormality, it is only in the advanced maternal age range that the risk of a chromosomally abnormal fetus exceeds the risk of miscarriage due to the procedure itself. The age cutoff used varies some

14、what among different prenatal genetics centers but is usually at least 31 to 32 years ofage.2 .Previous child with a de novo chromosome abnormality: If the parents of a child with a chromosome abnormality have normal chromosomes themselves, there may nevertheless be a risk of the same abnormality in

15、 a subsequent child. For example, if a woman under 30 years of age has a child with Down syndrome, the recurrence risk is about 1/100, in comparison with a general population risk of about 1/800. Prenatal mosaicism is possible explanation of the increased risk.re3 .Presence of structural chromosome

16、abnormality in one of the parents: He the risk of an abnormal child is usually 20% or less, but it may be higher4 .Family history of some genetic defect that may be diagnosed or ruled out by biochemical or DNA analysis: Most of these disorders are caused by single-gene defects and have risks of 25%

17、or 50% in sibs of affected children. Cases in which the parents have been diagnosed as carriers after a population screening test rather than after the birth of an affected child are also in this category. Even before DNA analysis entered the picture, numerous biochemical disorders could be identifi

18、ed prenatally, and DNA analysis has greatly increased the number.5 .Family history of an X-linked disorder for which there is no specific prenatal diagnostic test: When there is no alternative method, the parents may use fetal sex determination to help them decide whether to continue or terminate th

19、e pregnancy. With the development of DNA analysis for prenatal diagnosis of X-linked disorders such as Duchenne muscular dystrophy and hemophilia A and B, first the fetal sex is determined, and then DNA analysis is performed if the fetus is male.6 .Risk of a neural tube defect (NTD): Only first-and

20、second-degree relatives of NTD patients are eligible for amniocentesis because of a significantly increased risk of having a child with an NTD, but many fetuses with open NTDs can now be detected by other tests.第三节基因诊断利用分子生物学的技术，检测体内 DNA或RNA结构或表达水 平变化，从而对疾病做出诊断的方法，称为基因诊断（gene diagnosis、 通常又称为分子诊断（mo

21、lecular diagnosis）。基因诊断始于1978年， 应用限制性酶切长度多态性（RFLP）技术检测胎儿镰状细胞贫血症。 基因诊断技术已逐步从实验研究进入临床应用，不仅适用于遗传性疾 病，而且已扩展到一些感染性疾病、肿瘤的诊断。基因诊断具有如下特点：以特定基因为目标，检测基因的变化，特异性性强；采用分子杂交技术和PCR技术具有信号放大作用，用微量样品即可进行诊断，灵敏度高；在疾病尚无出现临床表现前，胎儿出生前的产前诊断，以及特定人群的筛查等，应用广泛；检测样品获得便利，不受个体发育阶段性和基因表达组织特异性的限制。需要说明的是，由于基因突变的类型多种多样，除了缺失、倒位、点突变、动态突

22、变可以进行基因的检测外，大多数基因突变的分析复杂而繁琐，有一定的难度。一、基因诊断的主要技术方法基因诊断主要采用核酸分子杂交、PCR和DNA序列测定等技术。（一）核酸分子杂交核酸杂交技术是在基因诊断中，用于检测样品中是否存在相应的基因以及相应基因表达状态等等。 其中Southern印迹法主要用于基因组 DNA 的分析， Northern 印迹法用于检测样品中RNA 的种类和含量。1. 斑点印迹杂交把待检测的核酸样品点在NC 膜上，变性后与标记的探针进行结合反应，经过显色和显影后检测杂交信号的强度，与对照样品比较后确定所测核酸量的高低。根据NC 膜上所点核酸样品的种类不同，分为 DNA dot

23、blotting和RNA dot blotting。点样 方式如采用狭缝点样器点样，得到的线状杂交信号，称狭线印迹法。2. 原位杂交把组织或细胞样品经过适当处理，用探针与核酸进行杂交。这种方法不需要提取核酸，可以确定被检核酸在组织或细 胞，以及中期染色体中的定位，具有重要的生物学和病理学意义。3. PCR-ASO ASO 为 等 位 基 因 特 异 性 寡 核 苷 酸 杂 交 法 （allele-specific oligonucleotide, ASO）的简称，是基于核酸杂交的一 种方法。根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备与野生型或突变型基因序列互补的两种探针，分别与被检测者样品中的

24、DNA 分子进行杂交，根据样品与两种探针杂交信号的强弱，确定是否存在基因突变，判断被检者是突变基因的纯合体或杂合体（图18-3） 。图18-3 ASO探针杂交原理示意图4. 基因芯片技术 基因芯片技术是近年来发展十分迅速的大规 模、高通量分子检测技术。基本过程是将许多特定的寡核甘酸片段或 基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，如玻片、硅片或 尼龙膜等，形成矩阵点。现在的技术可以做到在 1cm2上排列成千上 万个“点”。样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧 光标记分子，然后与待测样本进行杂交反应，再通过激光共聚焦荧光 显微镜对芯片进行扫描，获取信息，电脑系统分析处理所得

25、资料，对 上千种甚至更多基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确的检 测。基因芯片可以进行微量化、大规模、并行化、高度自动化地处理 有价值的生物样品，精细地研究各种状态下分子结构变异，了解组织 细胞基因表达情况。既可检测基因的多态性，又能检测基因突变，特 别适用于多个基因、多个位点的同时检测。这一技术目前处于发展和 优化阶段，已经有多种针对遗传性疾病、肿瘤检测的基因芯片用于临 床诊断。（二）其它常用的技术1. PCR-RFLP 将聚合酶链反应（PCR）与RFLP方法结合的一 种检测技术。由于DNA序列的差异，造成了内切酶位点的变化，或 是新酶切位点的产生；或是原酶切位点的消失等。通过酶切后电

26、泳图 谱的判断，确定检测结果。该方法包括 PCR:利用一对或数对特异 性引物，将目标DNA扩增；酶切：利用某些限制性内切酶消化 PCR 产物，如PCR产物中含有相应的酶切位点序列，DNA链则被切开； 利用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶分离酶切后的 PCR产物，根据电 泳图谱判断结果。如果某DNA序列已经全部确定，则可以通过计算机辅助设计特 异性PCR引物；扩增DNA片段和进行酶切位点分析，该方法简便易 行，精确度也很高。但是该方法也有一定的局限性，如果多态性位点的DNA序列没有相应的内切酶，则该方法不适用。2. PCR-SSCP 单链构象 多态性（single-strand conformatio

27、n polymorphism, SSCP）,是一种检测核酸序列中点突变的技术。当双 链DNA变性为两条单链后，会在中性条件下形成各自特定的空间构 象，因而在电泳时将在不同的位置上出现不同的电泳条带。如果DNA序列发生改变，甚至仅有一个碱基变化时，空间构象有可能发生改变， 电泳时表现出不同的迁移率，被检 DNA电泳条带与已知序列的对照 DNA电泳条带不一致，出现新生条带时，表明有突变存在（图18-4）。 该方法与PCR联合应用，因此称PCR-SSCR主要用于突变分子的初 步筛查。图18-4 SSCP原理示意图|3. RT-PCR 逆转录PCR以mRNA为模板合成cDNA,再进行 PCR,用于基因

28、表达水平的检测和分析。4. Western印迹技术 Western印迹技术是检测特定蛋白质的 方法，可用于某种与遗传病相关的蛋白质定性定量分析。如假肥大型 肌营养不良（DMD）患者基因缺陷使肌细胞的增强蛋白（dystrophin） 合成异常，采用 Western印迹法检测患者增强蛋白，进行诊断。二、基因诊断技术的应用（一）基因诊断在遗传病中的应用1 .镰状细胞贫血的基因诊断 镰状细胞贫血症的基因突变发生 在 珠蛋白基因内部，可以用限制性内切酶Mstll进行检测。基于编码 珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG,改变了限制性内切酶 Mstll的酶切位点。当酶切正常人 DNA和患者DNA后再用标

29、记的 珠蛋白基因为探针作Southern杂交时，就会出现不同的DNA条带。 限制性内切酶Mstll切割的序列是CCTNAGG （其中N是任何一种核 甘酸），切割正常DNA产生1.15kb DNA片段；若切割患者DNA时,形成 1.35kb 珠蛋白的DNA 片段，杂合体则形成1.15， 1.35两个片段（图11-7） 。2 血友病 A 的基因诊断血友病 A 是 X 连锁隐性遗传病，由于遗传性凝血障碍所致的出血性疾病。该病是凝血因子m（Factorm, F 川）基因的缺陷，其中大范围的基因重排（如缺失、插入和重复）只 占 5，主要突变类型为碱基取代或少数碱基的缺失和插入，这些突变产物可能是不完整的

30、、无活性的或不稳定的因子皿肽链，导致临床症状轻重不一。采用基因诊断方法可以检出有部分基因缺失的患者和女性携带者，可进行产前检查。对该基因的产前诊断可以通过RFLP连锁分析进行，在基因的内侧及旁侧有多组RFLP 位点可供基因诊断。目前多采用PCR技术与RFLP相结合的方法，先用PCR技术将包含突变 DNA 的片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶来酶切，电泳后直接检测多态性位点的状态。3 . 地中海贫血的基因诊断地中海贫血是由于基因的缺失造成的。链是由两对基因控制的，如果在一条16 号染色体上的2个 基因都缺失，称为0 地贫；如果一条16 号染色体上的2 个基因缺失一个，称为+地贫，这两种地贫基因可以组合引起不同的综合征。在基因的两端设计引物，扩增后的片段电泳，可以检测缺失突 变，确定被检测者的基因型，对可疑的胎儿进行产前诊断