病毒感染细胞试验整体流程及原理实用文档

1、病毒感染细胞实验整体流程及原理实用文档（实用文档，可以直接使用，可编辑优秀版资料，欢迎下载）病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求.1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1。1。1原理慢病毒（Lentivirus ）是逆转录病毒的一种。构建的 siRNA / miRNA 慢病毒载体，与化 学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠

2、传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。1。1。2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi研究和体内 实验中难于转染的细胞（比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞）.2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。4）无需任何转染试剂，操作简便。5）可以根据客户需要制备多种标记。1。1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。2）慢病毒载体，包装系统共转染病

3、毒包装细胞293T等。3）培养48hrs 72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。4）病毒的纯化和浓缩。5） 分装、一80 C保存.6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。1.2、腺病毒1。 2.1原理腺病毒（Adenovirus , Ad ）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近 50个血清型，大多数 Ad载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的 方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。1。 2.2特点1 ）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型（E1和E

4、3缺失）的腺病毒3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL ,能有效的进行增殖。4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。腺病毒包装简要流程1） 构建表达 siRNA/miRNA的腺病毒载体2）采用PacI消化纯化的质粒.3）消化好的腺病毒表达载体转染293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。4）将病毒粗提液感染 293A细胞以扩增病毒.5）分装,-80 C保存。1.3、 慢病毒和腺病毒的比较慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较病是表达系统慢病毒表达系统（Lentivirus ）

5、腺病毒表达系统（Adenovirus ）病是基因组RNA双链DNA复制自主复制自主复制是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时 间、稳定表达外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬 时表达外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适用于难转 染的原代细胞（如神经细胞）及体内实 验感染分裂和不分裂细胞表达风度中水平表达局水平表达表达时间慢（1 3天）快（12天）滴度滴度最高可达 10*8pfU/ml滴度最高可达10 * 11pfU/ml克隆容量可插入不超过8kb的外源片段滴度随 插入片段长度增加而降低可插入高达8kb的外源片段，滴度随 插入片段长度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、构建目

6、的基因到载体2.1 构建手段 一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到 载体,酶切，并测序鉴定2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定 2。2质粒载体2。2。1概念能够进行自主复制的环状 DNA双链Z构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿 体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸（DNA）分子2.2.2特征质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等.有些质粒称

7、为附加体（episome ），这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的 DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制 .通过个些特性，人们可 以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而 不断的复制，来得到目的产物。3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。3。1大肠杆菌感受态细胞的制备1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37 c振荡培养过夜。2）取0。4ml菌液转接到40mlLB液体培养基

8、中，37 C振荡培养23h3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置 10min4） 4 c 离心 10min（4000r/min）5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽6）用冰浴的0.1mol/L 氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴 30min7） 4 c 离心 10min （4000r/min ）8）倒出上清液，用冰浴的0。1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞，200ul 一份，4 c保存3。 2质粒DNA的转化1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min2）离心管放到42 C保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB 液体培

9、养基，37 c培养1h （150r/min ）5）取适当体积（100ul ）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置 30min6）倒置平皿37 C, 1216h,出现菌落3。3质粒提取步骤1）取14ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min ,弃上清2）加250ul溶液I /RNaseA （溶液I为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置 1-2min。3）加入250ul溶液n （细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀5 6次。室温放置12min ,使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。4）加入350ul溶液出（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会

10、出现白色絮状沉淀.5） 12000 室温离心10min ,收集上清。6）将上清置于 DNA纯化柱中，静置 1 2min 。7） 12000 转离心1min ,弃滤液.8）加入500ul溶液PB（洗涤液）12000转离心1min ,弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的 蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒 DNA。9）加入500ul溶液 W （去盐液），12000转离心1min ,弃滤液，重复一次。10） 12000转离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体.11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50100ul溶液日uent （为无菌的双蒸水，PH为8。08.5）,室温放置 2min 。12

11、）12000 转离心1min ,此时管底即为高纯度的质粒DNA ,质粒于-20 C保存.质粒提取步骤：吸取液体培养基于 1。5ml离心管中12000转离心1min,弃上清，吸取培养 基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于一20 c加250ulBufferS1悬浮细菌悬浮均匀-一加250ulBufferS2温和充分的上下翻转 4 6次混合均匀，使菌体裂解加350ulBufferS3温和上下翻转12000离心10min 取上清液转移到专用的制备管（2ml） 12000转离心1min,弃滤液加500ulBufferW112000转离心1min ,弃滤液一-加500ulBuffer

12、W212000 转离心1min ,弃滤液，重复一遍一- 将制备管置回2ml离心管12000转离心1min -将制备管移入新的1.5ml离心管中，加 6080ulEluent或离子水，室温1min12000 转离心1min 移去制备管，将有质粒的 离心管于4 c或是一20 c保存4、质粒DNA和其他包装质粒共转染 293T细胞产生病毒（即病毒包装 ）4.1 名词解释293T细胞是由293细胞派生，表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系,被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白，或是用以包装病毒。脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合

13、而释放。4.2 共转染的操作步骤第一天：用无抗生素 DMEM+10%FBS 铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达 至IJ 80%-90%融合度第二天：1。 500ul无血清培养基稀释 2ug 表达质粒+1 。 5ug psPAX2+1 。 5ug pMD2 。 G2。500ul无血清培养基稀释 15ul脂质体20003. 5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min4。从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。5。6-10h后，移除含有DNA 一脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液 DMED+10 %FB （从此刻开始算时间）。第三

14、天：1 .转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上第四天：1 .转染后48和72h分别收获含病毒的上清。2.3000 rpm 离心20min , 0.45um 滤膜过滤，去除细胞沉淀 .3.12000转离心浓缩细胞、分装一 80 C贮存。4。滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。4。3病毒包装的原理质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（ RNA ），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过lipofectamine2000进行三质

15、粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因 RNA与psPAX2、pMD2.G 基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质 RNA反转录出DNA ,该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒 DNA只能转录出病毒 RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋 白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。5、慢病毒感染细胞5。1流程图5.2感染步骤1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按 1*10

16、5/L密度接种于12孔板，生长过夜2）感染：将70 80 %铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入 PBS浓度 梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。3） 24h左右可换液,48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看5。3荧光显微镜的操作流程打开荧光器（30min内不能关闭，否则影响显微镜寿命 ，细胞培养板置于载物台，调节 物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光 ，开启荧光通道，观察荧光强度，判定感 染率。图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。（针对leica）5。4注意事项内容1 .病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，

17、对细胞有伤害。2。感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度，在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基.3。在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。4。在加病毒后一般 24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体时间根据细胞状态来看。6、感染后的细胞检测方法6.1 荧光初步检测若有荧光，则表示病毒感染成功，但并不能确定目的基因是否整合到细胞中彳寺进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。6。2RNA 的提取及 RT-PCR检测6.2 。 1原理因为真核细胞DNA含有很多非编码区，真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切 和拼接，去掉这些非编码区，才能形成真正的mR

18、NA,是否表达真核生物的基因并表达相应 的蛋白，只能通过提取其mRNA并RTPCR这条途径来测定RNA提取步骤力口 ImlTrizol ,吹打后移至1.5ml无菌的离心管中；加100ul氯仿剧烈振荡30s混匀,12000转15min ,可看到明显分层；取上层透明液体至新的1。5ml离心管中，加等体积的异丙醇，混匀静置 10min , 12000转离心10min,弃上清，力口 1ml70 %乙醇,12000转，离 心10min ,弃上清，风干剩余液体，最后加DEPC水溶解RNA,电泳，粗步判定RNA纯度。 6。2。3RT-PCR 步骤：RT是一个逆转录的过程，用前一天提取好的总RNA ,在加入引

19、物，模版和酶，并在PCR仪的温度设置下，RNA可逆转录为cDNA.PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下进行复制成双链DNA.（具体步骤省略）6.3 蛋白提取及Western 检测western Bloting :蛋白免疫ER迹（ Western blotting 或 Immunoblotting ） 一般 由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上 ，用得最多的材料是硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又

20、有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后， 再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中扫一扫，有福利,广州然科生物科技有限公司Q Guangzhou Ranke Biotech Co.,Ltd.联系方式：联系人：李经理手机:159 0204 0850邮箱：rankebioQQ

21、: 1046485526网址：院内感染病例上报操作流程点击进入医生工作站后查找到需要报告的病人，选择电子病历菜单进 入电子病历界面，在左边点击卫生报告进入院内感染报告界面，点击新（New）建后出现院内感染报告界面。界面包括病人基本信息、 手术信息、院内感染信息、辅助检查信息、抗生素使用信息、病程及 原因分析部分。1、 病人基本信息填写疾病转归、与死亡关系、入住ICU情况;易感因素；1-18项如果 没有相关的，一定填写19项（其它），此界面不要点击保存。2、 手术信息在手术情况栏中选择手术名称，点击手术名称后呈淡蓝色，不要在 小框内打；在一般信息栏逐项填写，点击保存.保存后手术名称行小 矿内自然

22、出现，后面有手术时间受术者等。3、 院内感染信息逐项填写感染部位、日期、诊断、侵袭性操作开始、侵害性操作结束，感染结束日期、天数不填写。侵害性操作必须填写，如果无 1-22 项，请填写23项（其它），然后保存。4、 辅助检查信息在辅助检查报告栏选择一项相关内容，并使其呈淡蓝色，不要在小 框内打；在病原学检查信息栏逐项填写，然后保存.5、 抗生素应用情况在抗生素类药物应用栏选择相应的抗生素，使其呈淡蓝色，不要在小框内打；在抗生素使用信息栏中逐项填写、保存.6、 病程及原因分析简单叙述诊断依据及治疗过程，主要叙述感染病程及病原菌；简单叙述病程及原因分析；最后上报，出现上报成功感染病例上报打印方法1

23、、从黄图标（桌面）MedTrak-临床子系统点击进入感染上报系统一最左上角报告一上报院内感染一上报院内感染查询一在下面找出本科一选日期-查询一双击感染病例-导出word-打印病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1。1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus） 是逆转录病毒的一种。构建的 siRNA / miRNA!病毒载体， 与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA载体相比，一方面 可以扩增替代瞬时表达载体使用，另

24、一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细 胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的 基因组，进行长时间的稳定表达。1。1。2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研 究和体内实验中难于转染的细胞（比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞）。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。4）无需任何转染试剂，操作简便。5）可以根据客户需要制备多种标记。1。1。3慢病毒包装简要流程：1）含有

25、目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T等。3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。4）病毒的纯化和浓缩。5）分装、一80 C保存。6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告.1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒（Adenovirus , Ad）是一种无包月M的线状双链 DNAW毒，其复制不依 赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和 5,通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅 在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效

26、控制系 统。1.22特点1）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型 （E1和E3缺失）的腺病毒3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL能有效的进行增殖。4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单。5）感染细胞时，不整合到染色 体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险， 生物安全性高。1。2.3腺病毒包装简要流程1）构建表达siRNA/miRNA的腺病毒载体2）采用PacI消化纯化的质粒。3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。4）将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。5）分装，-80 C保存。慢病毒载体系统和腺病毒

27、毂体系统比较晒卷衣达系统慢病毒表系统tLeiiGvirus）1区病毒表足系统t AdenoYirus J病毒膝同势1RNA病用双鞋ONA病毒复制I f玉复制白上复削足杏里介痫等基因组整合于宿主基因组.长时 闸、稳定表达外源基因痛毒基因旅游寓于宿主基因组外,M时表达外源堤因感非细胞先期感奥分裂相不分裂匏胞.适用于雌转 柒的原代细胞如池-洌胞 及体内 实物感於分裂和不分翌细胞表达风度中水平表达高水平表达表达时间慢（i-3 X）快 ( 1-2滴及演变垃布町; IDpiUZml滴度日 ”"|-1"小 1。* 1 IpiU/nii克隆容班可插入不超过Skb的外源片段,滴度随插入片段长

28、度泗加而降低可插入高速糕b的外源片段，滴度随插入一段长度增加而降低免疫原性低免疫除件高免掖原件2、构建目的基因到载体2o 1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCFT增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并 测序鉴定2.2质粒载体2.2。1概念能够进行自主复制的环状 DN敝链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体 和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸（DNA分

29、子2.2。2特征质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。 有些质粒称为附加体（episome）,这类质粒能够整合进真菌的染色体， 也能从整 合位置上切离下来成为游离于染色体外的 DNM"子。质粒在宿主细胞体内外都可 复制。通过个些特性，人们可以把一些目的DNNt断构建在质粒中，通过转化入 大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物.3、质粒DNA&大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA&大肠杆菌里转化的三步骤。1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于

30、3mlLB培养基的试管中,37 C振荡培养过夜。2）取0。4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37c振荡培养23h3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min4） 4 c 离心 10min （4000r/min ）5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽6）用冰浴的0。1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴 30min7）4 C 离心 10min （4000r/min ）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞，200ul 一份，4 c保存3.2 质粒DNA勺转化1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰

31、浴30min2）离心管放到42 c保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37C培养1h （150r/min） 5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置 30min6）倒置平皿37C, 1216h,出现菌落3.3 质粒提取步骤1）取14ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min,弃上清2）加250ul溶液I /RNaseA （溶液I为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至 菌体完全重新悬浮，室温静置12min。3）加入250ul溶液H （细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀 5-6次。室温放置 1-2min,使菌体充分裂解，直至形成澄清

32、的裂解溶液。4）加入350ul溶液田（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀56次，此时会出 现白色絮状沉淀.5）12000室温离心10min,收集上清.6）将上清置于DNA屯化柱中，静置1-2min.7） 12000转离心1min,弃滤液。8）加入500ul溶液PB （洗涤液）12000转离心1min,弃滤液，目的是将硅胶膜上 吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA.9）加入500ul溶液 W（去盐液），12000转离心1min,弃滤液，重复一次。10）12000转离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。11）将DNA屯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液Eluent（

33、为无菌的 双蒸水,PH为8。08。5）,室温放置2min。12）12000转离心1min,此时管底即为高纯度的质粒 DNA质粒于-20 C保存.质粒提取步骤：吸取液体培养基于1。5ml离心管中12000转离心1min,弃上清， 吸取培养基重复离心弃上消离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于20加250ulBufferS1 悬浮细菌，悬浮均匀加250ulBufferS2温和充 分的上下翻转46次混合均匀，使菌体裂解一一加 350ulBufferS3温和上下翻 转12000离心10min-取上清液转移到专用的制备管（2ml）12000转离心1min, 弃滤液一-加500ulBufferW112

34、000转离心1min,弃滤液加500ulBufferW212000转离心1min,弃滤液，重复一遍将制备管置回 2ml离 心管12000转离心1min-将制备管移入新的1.5ml离心管中，加6080ulEluent 或离子水，室温1min12000转离心1min移去制备管，将有质粒的离心管于4c 或是-20 C保存4、质粒DN用口其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装）4。1名词解释4.1.1293T细胞是由293细胞派生，表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系，被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白，或是用以包装病毒。4.1.2脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用

35、于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。4.2共转染的操作步骤第一天：用无抗生素DMEM+10%F网 293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密 度达到80%- 90%虫合度第二天:1.500ul 无血清培养基稀释 2ug表达质粒+1。5ug psPAX2+1。5ug pMD2 G2. 500ul无血清培养基稀释15ul脂质体20003。5min后，将DNA容液和脂质体溶液混合，室温静止20min4。从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物5. 6-10h后，移除含有DNA月旨质体复合物的培养基，代之以正常培养液 DMED+10FB （从此刻开

36、始算时间）.第三天：1。转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上第四天：1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。2。3000 rpm 离心20min, 0。45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。3.12000转离心浓缩细胞、分装一80° C贮存。4.滴度测定目的基因检定，并出具检测报告4。3病毒包装的原理质粒DNA能转录出慢病毒遗传物质（RNA，但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋 白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外 壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过lipofectamine200

37、0 进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主 基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因 RNAW psPAX2 pMD2 G基因翻 译出的蛋白组装为慢病毒。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒.在第五天再用该病毒感染靶细胞，病 毒进入细胞后，其遗传物质 RNAS转录出DNA该基因再整合到靶细胞的基因组 中，完成转染过程，因为质粒DNAR能转录出病毒RNAF口表达目的基因却不能表 达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复 增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中.5、慢病毒感染细胞5.1流程图5。2感染步骤1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按 1*105/L密度接种于12孔板，生 长过夜2）感染：将7080%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加 入PBS»度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。3） 24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。5.3荧光显微镜的操作流程打开荧光器（30min内不能关闭