酵母培养操作规程

1、酵母培养操作规程交本文主要介绍酵母的选育、保种、培养的操作工艺等。目 录第一章 酵母扩培 （2）§1-1实验室扩培 （2）1培养基制备 （2）2接种操作 （3）§1-2生产现场扩培 （5）1准备工作 （5）2汉生罐接种操作 （5）3扩大罐扩培 （5）4二次（车间）扩大罐扩培 （6）第二章菌种保藏 （7）1实验室菌种保藏与活化 （7）2汉生罐菌种保藏与活化 （7）第三章 酵母检测 （8）§3-1 取样 （8）1扩培液、发酵液及待滤酒等的取样 （8）2酵母泥的取样 （8）§3-2 检测 （10）1酵母细胞形态检测 （10）2酵母细胞大小测定 （10）3酵母泥

2、外观检测 （11）4酵母细胞数和出芽率的测定（血球计数板法） （11）5酵母死亡率的测定（血球计数板法） （12）6酵母肝糖染色法 （13）7酵母凝聚性的测定 （14）8酵母死灭温度的测定 （15）9酵母发酵失重实验 （16）10酵母的呼吸缺陷型检测 （16）第一章酵母扩培§1-1实验室扩培1培养基制备【试剂】：冷麦汁、蒸储水、新鲜鸡蛋。【器具】：试管（15X 150）及（18X180）、小巴氏瓶（三角瓶）、大巴氏瓶（大三角瓶）、卡氏罐、中速滤纸、电炉、量筒、不锈钢锅、糖度计等。【仪器】：杀菌锅、天平（精度 0.1g）。【方法】K试管、三角瓶及巴氏瓶培养基的制备力 取样：取糖化冷却麦

3、汁，视麦汁浊度情况判定是否进行过滤。2 C,按每0.51L使用一个鸡蛋的比例，加入打成泡沫的蛋清，在不断地搅拌下保温30min ;然后升温煮沸30min ;将煮沸后的麦汁用水浴冷至 8090 C,用双层中速滤纸过滤。4D 澄清：将麦汁加热至 450.2 °P。期调糖：将过滤后的麦汁用蒸储水调整糖度为11 分装：t管（15X150） 5mL,试管（18X180） 10mL,分装小巴氏瓶（三角瓶）、大巴氏瓶（大三角瓶）。 灭菌：分装后包扎好，115 c杀菌20min ;杀菌后培养基放置 23天，确定无菌后备用。K卡氏罐培养基的制备X取糖化冷却麦汁（有条件的可取薄板前热麦汁）加入卡氏罐，然

4、后封闭卡氏罐取样口，各呼吸阀等接口 处均应以棉塞或呼吸阀进行封闭后包扎结实，115 c杀菌3040min ,于室温冷却至1718 C;接种前以3L/min的速率充纯氧23min （卡氏罐有效容积 20L）。2接种操作【器具】：酒精灯、酒精棉、剪刀、接种针、镣子、定量移液器或吸管等。【仪器】：超净工作台等。【方法】无菌室使用前，使用紫外线灯照射 2030分钟进行杀菌；进入无菌室换无菌工作服；所有操作采用无菌操 作。K活化 操作前将冷冻管菌种置于室温下，使之内部培养基达到室温后，振荡均匀；无菌操作，将冷冻管内的培养液全部转入盛有 5mL培养基的试管中，于 25+1 C培养72±2小时。

5、将试管中的培养液轻轻振荡均匀，用接种环接取三环加入另一支盛有5mL培养基的试管中，于25±1 C培养2436小时。 将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀，用无菌吸管接0.1mL加入盛有10mL培养基的试管，振荡均匀后于25± 1 C培养2436小时。K扩大 将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀后，全部接入小巴氏瓶（三角瓶），每个小巴氏瓶（三角瓶）接入一支试管的培养液；然后于 23+1 C培养2436小时。 将培养结束的小巴氏瓶（三角瓶）轻轻振荡均匀后，全部接入大巴氏瓶（大三角瓶），每个大巴氏瓶（大三角瓶）接入一只小巴氏瓶（三角瓶）的培养液；然后于21±1 C培养243

6、6小时。 将培养结束的大巴氏瓶（大三角瓶）轻轻振荡均匀后，全部接入卡氏罐，每个卡氏罐接入两只大巴氏瓶（大三角瓶）的培养液；然后于18+ 1 C培养2436小时。K注X :除卡氏罐外，其它液体培养基在接种后每12小时应振摇一次，以去除二氧化碳，保证酵母耗氧需求。【实验室扩培工艺】容器扩大倍数培养温度C培养时间hr冷冻管-液体试管活化 25 1 + 72 2 +液体试管活化25 1 ± 2436液体大试管活化25 1 ± 2436小巴氏瓶（三角瓶）1023 1± 2436大巴氏瓶（大三角瓶）10211±2436卡氏罐10181± 2436注： 1.

7、 试管至三角瓶阶段，至少多做1-2 个（支）备用，防止出现意外情况，影响扩培。2. 卡氏罐接种前充纯氧，充氧速率3L/min ， 2-3min 。§1-2 生产现场扩培1 准备工作【设备准备】：每次扩培前应将待使用的自糖化至汉生罐、扩大罐的管路及汉生罐、扩大罐、连接管路、空气滤器进行刷洗和灭菌。【培养基灭菌】：取糖化冷却麦汁（有条件的可取薄板前热麦汁）加入汉生罐或扩大罐，进行升温杀菌。通常在常压下保持沸腾3040min 即可。杀菌后用无菌空气备压0.05MPa 后降温至14± 0.5 备用。2 汉生罐接种操作1:1015【通风】：保证酵母生长对氧的需求，具体通风量根据酵母生

8、长情况调整，若酵母细胞内出现空泡较多或细胞拉长现象，应适当增减通风量。【温度】：接种前控温在14± 0.5 ，接种后培养液自然升温至16 ，并保持16± 0.5 进行培养。【备压】：接种前备压0.05MPa ，接种后保持罐内正压。【培养时间】：接种后培养 3648hr ,待细胞浓度达到 3540X 106个/mL方可转罐。【检测】接种前的无菌麦汁及接种后的培养液，应作微生物检测。3 扩大罐扩培【接种】：扩大罐内接入冷麦汁（杀菌或不杀菌，保证麦汁无菌），将汉生罐内的培养液充分搅拌后，全部压入扩大罐（扩大比例1:56 ）。【通风】：具体通风量根据酵母生长情况调整，若酵母细胞内出

9、现空泡较多或细胞拉长现象，应适当增减 通风量。酵母起发后，应将流量和通风时间适当减少。【温度】：麦汁温度为12± 0.5 ，自然升温至14 ，并于14± 0.5 控温培养。【备压】：接种前备压0.05MPa ，接种后保持罐内正压。【培养时间】：培养 2436hr ,待酵母数达到3540X 106个/mL以上时，即可进行下一步扩培。4 二次（车间）扩大罐扩培将扩大罐的培养液充分搅拌后，全部压入二次（车间）扩大罐（扩大比例1:34 ）。再向二次（车间）扩大罐进充氧冷麦汁或对培养液进行适度通风（麦汁含氧量8mg/L 以上），料温控制11± 0.5 ，接种后自然升温至12

10、 C,并于1172 c保温培养；压力维持罐内正压； 培养24± 2hr,待酵母数达到3540X 106个/mL 以上时，即可进行追加麦汁或移入发酵罐进行繁殖。【车间扩大培养工艺】容 器 扩大倍数培养温度培养时间hr 充氧状况卡氏罐-汉生罐 1015161d3648根据情况进行调节扩大罐56141±2436根据情况进行调节二级扩大罐34121±24 2 ± 充氧麦汁浮选罐或发酵罐12101±24 2 ± 充氧麦汁发酵罐追加满罐约 1 工艺控温24 2 ± 充氧麦汁第二章 菌种保藏1 实验室菌种保藏与活化【形式】：保种形式分为冷

11、冻保种管和固体斜面保藏两种。冷冻保种管：青啤酵母以冷冻保种管的形式提供，-20-25 保藏，一次扩培使用一支。固体斜面 保藏：其它酵母菌种以固体斜面形式04 冷藏保藏，定期活化； 活化： 每三个月活化一次。接一环斜面菌种于5mL 麦汁液体培养基中，于 25± 1 培养 2436 小时；待酵母起发后，将培养液振荡均匀，用接种环涂划固体斜面，于25± 1 培养 6072 小时；然后于04 冷藏保藏。固体斜面菌种每年更换一次。2 汉生罐菌种保藏与活化【保种操作】 可将正在扩大培养的培养液由扩培罐压回至汉生罐，或直接将汉生罐的菌种留约1/5 扩培液追加杀菌麦汁进行保种。 培养 48

12、72 小时后，至糖度降至78° P 时，迅速将温度降至24 进行保种，压力为0.05MPa8 次。每月更换一次麦汁进行活化，汉生罐菌种使用及活化次数总共不超过【活化操作】将扩培罐麦汁杀菌降温至1213 备用。 将汉生罐内培养液通风搅拌后，全部转移至扩大罐中（扩大比1:56 ），于14± 0.5 进行培养，保持罐内正压，通风同扩培。待酵母数达到30X106个/mL以上时，将待留种的培养液打回汉生罐，按【保种操作】条操作剩余扩培液可打入发酵罐。第三章 酵母检测3-1 取 样1 扩培液、发酵液及待滤酒等的取样【器具】取样瓶、便携式喷灯、酒精喷雾器或酒精棉、打火机；【方法】 将取样

13、阀用75% 的酒精棉擦拭或酒精喷雾器喷洒酒精，用便携式喷灯或点燃酒精棉灼烧取样口（灼烧适度，避免损伤内部胶垫），进行清洁和灭菌； 然后打开取样阀，放出约1000mL 液体，关闭取样阀； 再次用酒精棉擦拭后，先打开取样阀，调整合适的流速，防止液体在取样时迸溅，用取样瓶接取样品约 300mL ，封闭取样瓶口； 关闭取样阀，用酒精喷雾器喷洒酒精或用酒精棉擦拭，对其进行清洁和灭菌。2 酵母泥的取样【器具】取样瓶、便携式喷灯、酒精喷雾器或酒精棉、打火机；【方法】A 回收罐的取样 将取样阀用75% 的酒精棉擦拭或酒精喷雾器喷洒酒精，进行清洁和灭菌； 然后打开取样阀，放出约1000mL 酵母泥，关闭取样阀；

14、 先打开取样阀，调整合适的流速，防止酵母泥在取样时迸溅，用取样瓶接取样品约200mL 后，封闭取样瓶口； 关闭取样阀，用酒精喷雾器喷洒酒精或用酒精棉擦拭，对其进行清洁和灭菌。B 锥形罐的取样 将锥底阀用75% 的酒精棉擦拭或酒精喷雾器喷洒酒精，进行清洁和灭菌； 然后打开锥底阀，放出底部掺有凝固物的酵母泥，至流出洁白的酵母泥时关闭锥底阀； 再次用酒精棉擦拭后，先打开锥底阀，调整合适的流速，防止酵母泥在取样时迸溅，用取样瓶接取样品约 200mL 后，封闭取样瓶口； 关闭锥底阀，用清水将阀内冲洗干净。§3-2 检 测1 酵母细胞形态检测【适用】扩培液、发酵液、待滤酒、酵母泥等【原理】在酵母

15、菌的各个生长时期，利用显微镜对酵母细胞的外形及内容物等进行观察。【器具】显微镜、载玻片、盖玻片等。【方法】 样品取回后，应立即进行检测；若不能立即检测，应置于冰箱保存，保存时间为06 不超过2 小时； 取一滴样品或少量菌体于载玻片上，加数滴蒸馏水，用拇指和食指夹住盖玻片两侧，将其轻轻的盖于样品上面，注意不要产生气泡，用显微镜进行检查； 先使用显微镜低倍物镜（X0）,调整载玻片位置，对准样品视野后换用高倍物镜（>40）观察； 优良的酵母菌种呈圆形或卵圆形，细胞较饱满，细胞膜较薄，胞内液泡较小，形态整齐一致；无异状（拉长）细胞。若观察扩培液，则出芽率较高，酵母大小的一致性稍差。2 酵母细胞大

16、小测定【适用】扩培液、发酵液、待滤酒、酵母泥等【原理】采用已用镜台测微尺校正过的目镜测微尺和显微镜测定单细胞的大小。【器具】显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片等。【方法】 将目镜测微尺装入目镜内，刻度朝下，并将镜台测微尺置于载物台上； 用低倍镜观察到镜台测微尺刻度； 换用高倍镜测量，先用镜台测微尺标定，计算出目镜测微尺每格的长度。移动镜台测微尺和转动目镜测微尺，使二者的刻度平行，并使两尺的第一条线重合，向右寻找另外相重合的直线，记录两重合刻度间目镜测微尺和镜台测微尺的格数，由下列公式计算目镜测微尺每格的长度；由于镜台测微尺每格长度为10gm,从镜台测微尺格数，求目镜测微尺每格长度（

17、 gm） o两重合刻度间镜台测微尺格数 X10目镜测微尺每格长度（gm）= 两重合刻度间目镜测微尺格数 取下镜台测微尺，换上酵母制片，在高倍镜下测量1020 个酵母细胞的直径。3 酵母泥外观检测【适用】酵母泥【原理】应用目测方法对酵母泥的外观进行判断。【器具】取样瓶、灯光。【方法】 样品取回后，应立即进行检测；若不能立即检测，应置于冰箱保存，保存时间为06 不超过2 小时。 将样品置于光线充足处，用肉眼观察。现场使用的酵母泥应有新鲜的光泽，呈乳白色；用手捻开时松散且不粘连。若色泽灰暗、发粘、有臭酵母味，则说明酵母泥的质量较差。4 酵母细胞数和出芽率的测定（血球计数板法）AA【适用】扩培液、发酵

18、液、待滤酒等【原理】如图所示，血球计数板的计数室分 25个中格，每个中格又分16个小格，所以计数室内共有25X16 =400个小格；计数室的容积为 1mm （长）Mmm （宽）X0.1mm （高）=0.1 mm3 = 1 10-4mL ;通常计数 5 个 “ A” 区的酵母细胞总数。【器具】显微镜、血球计数板、盖玻片等；【试剂】1M H2SO4 固定液【方法】 样品取回后，应立即进行检测；若不能立即检测，应用1MH2SO4 固定液对样品进行固定；样品稀释前应充分振荡均匀，以保证测定结果反映样品本质。 取50mL容量瓶加入蒸储水约 30mL和1M的H2SO4固定液约2mL,再加入样品进行适当稀释

19、定 容，使计数时计数板内中格内细胞数在30 个左右。 用拇指和食指夹住盖玻片两侧，将其轻轻的盖于清洁的计数板上面；将稀释好的酵母悬液充分振荡均匀，用清洁的加样器吸取少许，从盖玻片的边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 静置 12min ，置于显微镜下计数。 计数5个中格“却的细胞总数（包括出芽的细胞）和出芽细胞数。【计算】酵母细胞数（个/mL ） = 5ABX104 其中A5 个中格的酵母细胞总数；B 稀释倍数。出芽率（） = 5个中格的出芽细胞数/5个中格的细胞总数X100【注意】*计酵母数时，位于格线上的酵母菌，一般只计此格的上方及右方线上的菌体；* 测定酵母菌出

20、芽率时，当芽细胞大于或等于母细胞的1/2 时计为两个细胞，不作出芽计；当芽细胞小于母细胞的1/2 时，该细胞计为一个出芽细胞。5 酵母死亡率的测定（血球计数板法） 【适用】扩培液、发酵液、待滤酒、酵母泥等【原理】酵母细胞具有还原次甲基紫的一种还原酶。当酵母细胞浸于次甲基紫溶液时，色素渗入细胞内，活细胞内的还原酶将其还原脱色；死细胞的还原酶失活，不能将其脱色，细胞被染成红色。【器具】显微镜、血球计数板、盖玻片等【试剂】次甲基紫染色液C =0.01% （W/V）:将0.01g次甲基紫溶于2% （W/V）二水柠檬酸钠溶液，定容至 100mL 。【方法】 样品取回后，应立即进行检测；若不能立即检测，应

21、置于冰箱保存，保存时间为06 不超过2 小时；样品稀释前应充分振荡均匀，以保证测定结果反映样品本质； 先把待测的酵母菌（液）用蒸馏水稀释至每中格中含有大约4070 个左右酵母菌； 取 1mL 预先稀释好的酵母菌悬液加入试管，再加入1mL 次甲基紫染色液，摇匀后染色45min ； 用拇指和食指夹住盖玻片两侧，将其轻轻的盖于清洁的计数板上面；将染色的酵母悬液充分振荡均匀，用清洁的加样器吸取少许，从盖玻片的边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡； 将血球计数板置于显微镜下观察，死细胞被染成红色； 计数5个中格“却（见4之图示）的细胞总数和死细胞数。【计算】酵母死亡率（）=（染色

22、酵母数/酵母总数）X100%6 酵母肝糖染色法【样本】扩培液、发酵液、待滤酒、酵母泥等【原理】肝糖是酵母细胞内的贮藏物质，通过肝糖检测可判别酵母的营养状况；碘化钾可将肝糖染成红褐色，从而使含有肝糖的酵母细胞内部颗粒呈现红褐色。【器具】显微镜、血球计数板、盖玻片等；【试剂】 碘液： 称取 1g 碘和 3g 碘化钾于研钵中充分研磨均匀，然后在不断搅拌下加入50mL 水进行溶解，稀释至 60mL ，于棕色瓶中保存使用，有效期一个月。【方法】 样品取回后，应立即进行检测；若不能立即检测，应置于冰箱保存，保存时间为06 不超过2 小时；样品稀释前应充分振荡均匀，以保证测定结果反映样品本质； 先把待测的酵

23、母菌（液）用蒸馏水稀释至每中格中含有大约4070 个左右酵母菌； 取 1mL 预先稀释好的酵母菌悬液加入试管，再加入1mL 碘液，摇匀后染色45min ； 用拇指和食指夹住盖玻片两侧，将其轻轻的盖于清洁的计数板上面；将染色的酵母悬液充分振荡均匀，用清洁的加样器吸取少许，从盖玻片的边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 将血球计数板置于显微镜下观察，细胞菌体呈黄色，肝糖颗粒被染成红褐色； 计数5个中格“却（见4之图示）的细胞总数和含有染色颗粒的细胞数。【计算】酵母肝糖染色率（）=（含有染色颗粒的酵母数/酵母总数）X100%7 酵母凝聚性的测定【适用】酵母泥等【原理】应用硫

24、酸钙促凝作用，在酵母沉降一定时间时，利用光密度的方法对其沉降程度进行评估。【器具】离心机（配50mL 塑料离心管）、电子台秤（0.01g ）、分光光度计、比色管（25mL 和 50mL ）、定量吸管（3mL ）；【试剂】 醋酸缓冲液：将0.51g 硫酸钙、6.80g 醋酸钠和4.05g 冰醋酸溶于水中，定容至1000mL ； EDTA 溶液C（ EDTA） =0.01M ：将 3.73g EDTA 溶于水中，定容至1000mL ；【方法】 样品取回后，应立即进行检测；若不能立即检测，应置于冰箱保存，保存时间为06 不超过2 小时； 离心：将酵母泥样品振荡均匀，加入50mL 离心管内约40mL

25、，于 4000rpm 转速离心10min ，弃上清液； 洗涤： 称取离心酵母泥1.00g 于离心管中，加入 0.01M 的 EDTA 溶液 20mL 充分振匀后，于 4000rpm离心 10min ，弃上清液；再次加入相同数量的EDTA 溶液充分振匀，进行洗涤后离心，弃上清液，备用； 转移：在上述酵母泥沉淀中加入醋酸钠缓冲溶液，并将酵母泥洗涤至50mL 比色管中，用醋酸钠缓冲溶液定容至50mL ；转移应尽快完成。 静置：将移入酵母泥悬液的50mL 比色管迅速放入20恒温水浴中保温30min ； 比色：用定量吸管迅速吸取保温后的50mL 比色管的最上端的3mL 液体，并于比色杯内混匀后，于 67

26、0nm 以醋酸钠缓冲液为空白测得吸光度B； 原始浊度：称取离心酵母泥0.50g 于离心管中，加入0.01M 的 EDTA 溶液 10mL 充分振匀后，于4000rpm 离心 10min ， 弃上清液；再次加入相同数量的EDTA 溶液充分振匀，进行洗涤后离心，弃上清液；用蒸馏水洗涤至25mL 比色管中并定容，充分振荡均匀后于670nm 以蒸馏水为空白测得吸光度A；【计算】酵母凝聚性（ ） = （A - B ） /A >100%8 酵母死灭温度的测定【适用】回收酵母、实验室菌种等【原理】培养基中一定量的菌体在不同的温度下保温一定的时间，其保温后不能生长的温度即为其死灭温度。 【器具】恒温水浴

27、 【试剂】11 ° P 麦汁液体培养基【方法】 分离：酵母泥取回后应立即进行划线分离，选取所需试验的菌落进行试验。 活化：将需要试验的纯酵母菌种（分离后或原始菌种）接一接种环于5mL 麦汁液体培养基中，于25培养36±2 小时活化； 富集：将活化后培养液振荡均匀后，将其接种三环于5mL 麦汁培养基；每一试验菌种共接8 支试管培养基。然后于25 培养4± 0.5 小时进行富集； 保温： 将恒温水浴调节温度至48± 0.5，将培养后的待测菌培养液振荡均匀，每只待测菌取两支试管，与一插有温度计的的麦汁培养基试管一起放入水浴；待麦汁试管的温度计的温度达到48 时

28、，开始计时保温 10min ；保温终止立即将试验试管移入冰水降温至室温。同样步骤进行50、52、54 的保温试验； 培养：将保温后的培养液置于25 培养 57 天，每天观察试管中有无菌体生长并记录； 结论：酵母不能生长的最低温度即为其死灭温度。9 酵母发酵失重实验 【适用】回收酵母等【原理】在实验室内使用低接种量，模拟生产现场发酵，通过称重方法推算其起发速度，从而评判酵母的性能。【器具】离心机（配50mL 塑料离心管）、电子台秤（0.01g ）【试剂】11 ° P 麦汁液体培养基【方法】 样品取回后，应立即进行检测；若不能立即检测，应置于冰箱保存，保存时间为06 不超过2 小时。 离心：将待试酵母泥样品充分振荡均匀，取约40mL 加入离心管，于4000rpm 离心 10min ，弃上清液； 接种：将盛有200mL 麦汁培养基的三角瓶置于电子台秤上调零，用无菌玻璃棒粘取离心后的酵母泥，接种于三角瓶0.4g （相当于接种比例2%。）； 称重：然后取下