新生隐球菌的致病机理

1、2021/4/272隐球菌病的致病菌2021/4/273CC.2021/4/274Mature basidiaPostmeiotic mitosisMeiosisKaryogamyin basidiumDikaryotic hyphaeConjugationHaploid cycleaa aLife CycleMATa X MATa a2021/4/275Blood streamBrainCryptococcosis: Route of infection and dissemination2021/4/276隐球菌病隐球菌病病原菌病原菌: :新生隐球菌新生隐球菌感染途径感染途径 : : 吸入

2、，皮肤，胃肠道？吸入，皮肤，胃肠道？分布分布 : : 世界范围世界范围 脑、肺、皮肤、骨和关节脑、肺、皮肤、骨和关节 HIV, HIV, 淋巴瘤淋巴瘤, , 激素治疗激素治疗, , 器官移植器官移植 原发性原发性CD4 CD4 淋巴细胞减少淋巴细胞减少未治疗的脑膜炎死亡率为未治疗的脑膜炎死亡率为100%100% 易感因素易感因素 : :易感器官：易感器官：预后预后 : :2021/4/277新生隐球菌的毒性因子新生隐球菌的毒性因子荚荚 膜膜黑黑 素素磷脂酶磷脂酶37 37 下生长良好下生长良好2021/4/278新生隐球菌致病机理中新生隐球菌致病机理中几个关键问题几个关键问题新生隐球菌是如何穿

3、过血脑屏障后进入中枢新生隐球菌是如何穿过血脑屏障后进入中枢神经系统的？神经系统的？为什么新生隐球菌易于感染中枢神经系统？为什么新生隐球菌易于感染中枢神经系统？新生隐球菌进入机体的途径是否只有吸入肺新生隐球菌进入机体的途径是否只有吸入肺部后入血一个？部后入血一个？2021/4/279新生隐球菌通过血脑屏障的机制研究新生隐球菌通过血脑屏障的机制研究人脐静脉内皮细胞（人脐静脉内皮细胞（HUVEC）建立血脑屏障）建立血脑屏障模型，观察新生隐球菌对模型，观察新生隐球菌对HUVEC的影响的影响 新生隐球菌静脉感染新生隐球菌静脉感染C57BL/6小鼠后，检测小鼠后，检测大脑皮质内新生隐球菌感染情况，大脑皮质

4、大脑皮质内新生隐球菌感染情况，大脑皮质内细胞凋亡及大脑皮质中特异蛋白的表达内细胞凋亡及大脑皮质中特异蛋白的表达 2021/4/2710Mouse model of cryptococcosis2021/4/2711 血脑屏障模式图血脑屏障模式图2021/4/2712 紧密连接紧密连接血脑屏障血脑屏障病原体病原体1231: 1: 细胞内侵袭细胞内侵袭2: 2: 细胞旁通过打开紧密连接细胞旁通过打开紧密连接3: 木马机制：通过巨嗜细胞穿越木马机制：通过巨嗜细胞穿越ECM巨嗜细胞巨嗜细胞病原体穿越血脑屏障的方式病原体穿越血脑屏障的方式 2021/4/2713HBMEC HBMEC 单层单层半通透膜半

5、通透膜Filter- Filter- insertinsert脑侧脑侧血液侧血液侧新生隐球菌新生隐球菌检测新生隐球菌通过血脑屏障的体外模型检测新生隐球菌通过血脑屏障的体外模型2021/4/2714新生隐球菌对血脑屏障内皮细胞凋亡的影响新生隐球菌对血脑屏障内皮细胞凋亡的影响 A: A: 对照组对照组 B: 2h C: 6h D: 12h B: 2h C: 6h D: 12h 新生隐球菌侵袭血脑屏障新生隐球菌侵袭血脑屏障ECEC细胞的凋亡率细胞的凋亡率 2021/4/2715新生隐球菌侵袭血脑屏障透射电镜新生隐球菌侵袭血脑屏障透射电镜A: A: 对照组对照组 B: 0.5h C: 0.5h D:

6、0.5h E: 0.5h F: 6h G: 6h H: 12h B: 0.5h C: 0.5h D: 0.5h E: 0.5h F: 6h G: 6h H: 12h 2021/4/2716新生隐球菌侵袭血脑屏障新生隐球菌侵袭血脑屏障ECEC扫描电镜结果扫描电镜结果 A: A: 对照组对照组 B: 2h C: 6h D: 12h B: 2h C: 6h D: 12h 2021/4/2717HUVEC Bcl-2HUVEC Bcl-2( (抑凋亡基因抑凋亡基因) )的表达被抑制的表达被抑制 A A：对照组：对照组 B B：2h C2h C：6h6h：D D：12h 12h 2021/4/2718H

7、UVEC Bax (凋亡基因)的表达被启动A A：对照组：对照组 B B：2h C2h C：6h6h：D D：12h 12h 2021/4/2719新生隐球菌对血脑屏障紧密连接通透性的影响新生隐球菌对血脑屏障紧密连接通透性的影响HUVEC 紧密连接相关蛋白表达紧密连接相关蛋白表达紧密连接胞质附着蛋白紧密连接胞质附着蛋白 ZO-1ZO-1血管渗透因子血管渗透因子VEGFVEGFIL-6IL-62021/4/2720新生隐球菌对新生隐球菌对C57BL/6小鼠大脑皮质作用研究小鼠大脑皮质作用研究 大脑皮质大脑皮质PASPAS染色染色 A A：C group BC group B：CTX CTX gr

8、oup Cgroup C：0.5h D0.5h D：2h 2h E E：6h F6h F：12h G12h G：24h 24h HH：72h72h大脑皮质透射电镜大脑皮质透射电镜 A A：C group BC group B：24h C24h C：72h 72h D D：C group EC group E：24h F24h F：72h 72h 2021/4/2721新生隐球菌对新生隐球菌对C57BL/6小鼠大脑皮质作用研究小鼠大脑皮质作用研究 小鼠大脑皮质Bcl-2在不同时相点的比较 不同时相点的小鼠大脑皮质凋亡细胞比较 不同时相点的小鼠大脑皮质Bax比较 2021/4/2722新生隐球菌对

9、新生隐球菌对C57BL/6小鼠大脑皮质作用研究小鼠大脑皮质作用研究 2021/4/2723初步结论初步结论新生隐球菌入血后到达血脑屏障，新生隐球菌入血后到达血脑屏障，通过相关细胞因子如通过相关细胞因子如IL-6IL-6和和VEGFVEGF等作用引起等作用引起脑微血管内皮细胞的凋亡，脑微血管内皮细胞的凋亡，紧密连接开放，细胞间隙增大，并可能使血脑紧密连接开放，细胞间隙增大，并可能使血脑屏障完整性被破坏，屏障完整性被破坏，穿越血脑屏障，感染宿主脑组织穿越血脑屏障，感染宿主脑组织 2021/4/2724隐球菌脑膜炎发病机制隐球菌脑膜炎发病机制l新生隐球菌的跨膜作用新生隐球菌的跨膜作用l穿越脑微血管内

10、皮细胞紧密连接穿越脑微血管内皮细胞紧密连接l脑微血管内皮细胞凋亡脑微血管内皮细胞凋亡l其它相关因子导致的通透性的增加其它相关因子导致的通透性的增加2021/4/2725新生隐球菌嗜中枢性的研究新生隐球菌嗜中枢性的研究利用蛋白质组学技术分析新生隐球菌与利用蛋白质组学技术分析新生隐球菌与血管内皮细胞共孵育后血管内皮细胞蛋血管内皮细胞共孵育后血管内皮细胞蛋白质谱的变化白质谱的变化筛选差异表达蛋白，并在基因的转录层筛选差异表达蛋白，并在基因的转录层面进行验证面进行验证 2021/4/2726血管内皮细胞总蛋白差异表达谱血管内皮细胞总蛋白差异表达谱 实验组蛋白二维凝胶电泳图谱实验组蛋白二维凝胶电泳图谱

11、对照组蛋白二维凝胶电泳图谱对照组蛋白二维凝胶电泳图谱2021/4/2727实验组与对照组细胞蛋白表达差异实验组与对照组细胞蛋白表达差异共找到可信差异表达蛋白点共找到可信差异表达蛋白点1919个个5 5个蛋白点仅在对照组细胞中表达个蛋白点仅在对照组细胞中表达3 3个蛋白点仅在实验组细胞中表达个蛋白点仅在实验组细胞中表达1010个蛋白点在实验组细胞中表达降低个蛋白点在实验组细胞中表达降低1 1个蛋白点在实验组细胞中表达升高个蛋白点在实验组细胞中表达升高 2021/4/2728差异表达蛋白点肽指纹谱鉴定差异表达蛋白点肽指纹谱鉴定 S100A10S100A10Prx Prx Prohibitin (P

12、HB)Prohibitin (PHB) HSP27HSP27Malate dehydrogenase Malate dehydrogenase CacyBP CacyBP PSA7_HUMAN PSA7_HUMAN cofilin cofilin 2021/4/2729隐球菌嗜中枢性可能的相关机制隐球菌嗜中枢性可能的相关机制增强细胞骨架活动能力，促进细胞胞吞胞吐活动增强细胞骨架活动能力，促进细胞胞吞胞吐活动 减少减少HUVECHUVEC对氧应激的耐受能力，细胞损伤增对氧应激的耐受能力，细胞损伤增加，增殖能力下降加，增殖能力下降 促进细胞凋亡促进细胞凋亡 影响了影响了HUVECHUVEC正常的细

13、胞内信号转导过程正常的细胞内信号转导过程 抑制细胞能量代谢抑制细胞能量代谢 2021/4/2730皮肤隐球菌感染的研究皮肤隐球菌感染的研究小鼠原发性皮肤隐球菌感染模型的建立小鼠原发性皮肤隐球菌感染模型的建立宿主免疫状态、隐球菌变种和荚膜与皮肤宿主免疫状态、隐球菌变种和荚膜与皮肤隐球菌感染的关系隐球菌感染的关系小鼠隐球菌皮肤感染后是否发生播散小鼠隐球菌皮肤感染后是否发生播散人角质形成细胞株人角质形成细胞株HaCatHaCat体外与新生体外与新生隐球菌相互作用隐球菌相互作用 2021/4/27312021/4/2732小鼠原发性皮肤隐球菌感染模型小鼠原发性皮肤隐球菌感染模型传染性软疣样皮损传染性软

14、疣样皮损溃疡溃疡结节样皮损结节样皮损PASPAS染色染色 2021/4/2733小鼠隐球菌感染后的血行播散小鼠隐球菌感染后的血行播散免疫抑制与免疫正常小鼠各个脏器及血液真菌培养免疫抑制与免疫正常小鼠各个脏器及血液真菌培养均为阴性均为阴性免疫抑制小鼠血清乳胶凝集试验免疫抑制小鼠血清乳胶凝集试验阳性阳性 乳胶凝集试验是目前比较成熟的技术，在去除试验乳胶凝集试验是目前比较成熟的技术，在去除试验本身因素影响后，其阳性率接近本身因素影响后，其阳性率接近100100 免疫严重受损的患者，皮肤局部创伤后大剂量接种免疫严重受损的患者，皮肤局部创伤后大剂量接种隐球菌还是可能引起播散性的隐球菌感染隐球菌还是可能引

15、起播散性的隐球菌感染 2021/4/2734隐球菌皮肤致病性中的影响因素隐球菌皮肤致病性中的影响因素免疫抑制的作用可以使隐球菌感染皮损出现免疫抑制的作用可以使隐球菌感染皮损出现时间提前，感染加重。时间提前，感染加重。无荚膜株与父代有荚膜株在皮肤的致病力方无荚膜株与父代有荚膜株在皮肤的致病力方面没有明显差别面没有明显差别 两个变种之间的致病力没有显著差别两个变种之间的致病力没有显著差别2021/4/2735新生隐球菌与角质形成细胞的体外相互作用新生隐球菌与角质形成细胞的体外相互作用 新生隐球菌对角质形成细胞的时间粘附率0%5%10%15%20%25%30%35%0.5124时间：h粘附率cap6

16、4B3501ATCC32609新生隐球菌对角质形成细胞的时间通过率0%5%10%15%20%25%2468时间：h通过率cap64B3501ATCC32609新生隐球菌对角质形成细胞活力的影响0510152025300.512时间：h调亡率：cap64B3501ATCC32609空白对照killed-B3501不同共同培养方式对角质形成细胞活力的影响0510152025300.5h1h2h时间调亡率：cap64cap64不接触B3501B3501不接触killed-B3501ATCC32609ATCC32609不接触空白对照2021/4/2736透射电镜观察新生隐球菌与角质形成细胞的作用透射电

17、镜观察新生隐球菌与角质形成细胞的作用 角质形成细胞中的角质形成细胞中的B3501B3501，可见菌体正在出芽。可见菌体正在出芽。角质形成细胞中的角质形成细胞中的cap64cap64，可见菌体中出现空泡。可见菌体中出现空泡。2021/4/2737新生隐球菌触发角质形成细胞表面蛋白酪氨酸残基磷酸化新生隐球菌触发角质形成细胞表面蛋白酪氨酸残基磷酸化空白对照空白对照 B3501作用作用2h cap64作用作用2hGenistein预处理前后粘附率的比较0%5%10%15%20%25%30%35%0.5124时间：h粘附率cap64cap64-预处理B3501B3501预处理ATCC32609预处理ATCC32609-Genistein预处理前后隐球菌通过率的比较0%5%10%15%20%25%24