生物化学第34章兰州大学经典课件DNA的复制和修复

1、1第34章 DNA的复制和修复（DNA replication and repair）一、一、DNA的复制的复制二、二、DNA的损伤修复的损伤修复三、三、DNA的突变的突变2一、DNA的复制（一）（一）DNA的半保留复制的半保留复制3DNA复制的三种可能模式 Conservative Semiconservative dispersiveAfter onegenerationAfter twogenerations4Watson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型oldnew5DNA半保留复制的实验证明 1958年，年，Meselson和和Stahl利用利用15N标记大肠标记大肠杆菌杆菌DN

2、A的实验，首先证明了的实验，首先证明了DNA的半保留复制。的半保留复制。他们让大肠杆菌在以他们让大肠杆菌在以15NH4Cl为唯一氮源的培养为唯一氮源的培养基中生长，经过连续培养基中生长，经过连续培养12代，使所有的代，使所有的DNA分分子都标记上子都标记上15N。15N-DNA的密度比普通的密度比普通14N-DNA大，在氯化铯密度梯度离心时可以区分这两种大，在氯化铯密度梯度离心时可以区分这两种DNA。6DNA半保留复制的实验证明 这时将大肠杆菌转移到普通培养基（含这时将大肠杆菌转移到普通培养基（含14N）上培养，经过一代以后，所有上培养，经过一代以后，所有DNA的密度都介于的密度都介于15N-

3、DNA和和14N-DNA之间，说明这时的之间，说明这时的DNA为为14N和和15N的杂合分子。两代后，的杂合分子。两代后，14N分子和杂合分子分子和杂合分子等量出现。当把杂合分子加热，使它们分开成单等量出现。当把杂合分子加热，使它们分开成单链再离心，可见有一半与单链链再离心，可见有一半与单链15N-DNA的密度相的密度相同，另一半与单链同，另一半与单链14N-DNA的密度相同。的密度相同。7The Meselson-Stahl experimentDNA extracted and centrifuged to equi- librium in CsCl density gradient8（二

4、）DNA复制的起点和方式 DNA上能独立进行复制的单位称为复制子上能独立进行复制的单位称为复制子（replicon），每个复制子都有复制起始点，可能），每个复制子都有复制起始点，可能还有复制的终点。还有复制的终点。DNA复制起始点一般有特定的复制起始点一般有特定的序列，序列，DNA在复制起始点处解开双链，形成一个在复制起始点处解开双链，形成一个复制泡（也叫复制眼）。有些复制泡（也叫复制眼）。有些DNA的复制从复制的复制从复制起始点开始起始点开始向两边复制向两边复制，也有些，也有些DNA的复制从复的复制从复制起始点开始制起始点开始向一边复制向一边复制，它们分别称为，它们分别称为双向复制双向复制和

5、和单向复制单向复制。9DNA复制的方向未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制10DNA复制的方向 先将大肠杆菌在含有少量先将大肠杆菌在含有少量3H标记的胸腺嘧啶的培养基中标记的胸腺嘧啶的培养基中培养，然后换到含有大量培养，然后换到含有大量3H标记的胸腺嘧啶的培养基中短时标记的胸腺嘧啶的培养基中短时间培养，放射自显影可以观察到复制叉。间培养，放射自显影可以观察到复制叉。11中国仓鼠卵巢细胞DNA复制的电镜照片 大箭头所指大箭头所指为复制泡，小箭为复制泡，小箭头所指为复制叉头所指为复制叉处的单链部分，处的单链部分，注意两个复制叉注意两个复制叉处的单链部分在处的单链部分在相反的链上。相反

6、的链上。12各种生物DNA的结构 DNA有线性双链和环状双链的，也有环状单有线性双链和环状双链的，也有环状单链的。原核生物的染色体链的。原核生物的染色体DNA和质粒，以及真核和质粒，以及真核细胞中的线粒体和叶绿体细胞中的线粒体和叶绿体DNA都是双链环状的，都是双链环状的，真核生物的染色体真核生物的染色体DNA是双链线性的。病毒的是双链线性的。病毒的DNA有单链环状的，也有双链环状的，还有双链有单链环状的，也有双链环状的，还有双链线性的。线性的。13DNA上复制子的数目 原核生物原核生物染色体染色体DNA和质粒和质粒DNA就是一个复就是一个复制子，从一个复制起始点开始完成整个制子，从一个复制起始

7、点开始完成整个DNA分子分子的复制。真核细胞一个染色体的复制。真核细胞一个染色体DNA上有许多复制上有许多复制子，许多复制起始点同时开始复制，每一个复制子，许多复制起始点同时开始复制，每一个复制起始点完成一段起始点完成一段DNA的复制，然后将各个片段连的复制，然后将各个片段连接起来。接起来。14复制起始点的确定 大肠杆菌大肠杆菌染色体染色体DNA只有一个复制起始点。在只有一个复制起始点。在一个生长的群体中几乎所有细胞的染色体都在复制一个生长的群体中几乎所有细胞的染色体都在复制过程中，因此离复制起始点越近的基因拷贝数就越过程中，因此离复制起始点越近的基因拷贝数就越多，也就是出现的频率越高。将从大

8、肠杆菌中提取多，也就是出现的频率越高。将从大肠杆菌中提取出来的出来的DNA切成大约切成大约1%染色体长度的片段，通过分染色体长度的片段，通过分子杂交的方法测定各基因片段的频率，结果表明复子杂交的方法测定各基因片段的频率，结果表明复制起始点制起始点ori C位于基因图谱的位于基因图谱的ilv位点处（位点处（83分附分附近）。一旦复制开始，复制叉向两侧以相等的速度近）。一旦复制开始，复制叉向两侧以相等的速度向前移动。两个复制叉在离起始点向前移动。两个复制叉在离起始点180的的trp位点处位点处（33分附近）会合。分附近）会合。15大肠杆菌染色体DNA复制起始点的确定16大肠杆菌的多复制叉染色体17

9、DNA酶促合成的引物链和模板链18（三）DNA聚合反应有关的酶19DNA聚合酶催化的聚合反应5 端端3 端端DNADNA聚合酶聚合酶20DNA聚合酶的反应特点 以以4种种dNTP作底物；作底物； 反应需要接受模板的指导；反应需要接受模板的指导； 反应需要有引物反应需要有引物3-羟基存在；羟基存在； DNA链的延长方向为链的延长方向为53； 产物产物DNA的性质与模板相同。的性质与模板相同。21大肠杆菌DNA聚合酶 1955年，年，Arthur Kornberg等等发现了发现了大肠杆大肠杆菌菌DNA聚合酶，后来又发现了聚合酶，后来又发现了4种种DNA聚合酶，聚合酶，分别称为分别称为DNA聚合酶聚

10、合酶、和和，它，它们有各自不同的用途。们有各自不同的用途。（DNA polymerase）22The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acidSevero OchoaArthur KornbergNew York University, College of Medicine Stanford University23The Nob

11、el Prize in Chemistry 2006for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcriptionRoger D. KornbergStanford University Stanford, CA, USAb. 194724大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶由一条肽链（由一条肽链（928个氨个氨基酸残基）组成，含有一个锌原子，分子量基酸残基）组成，含有一个锌原子，分子量103kD。它是一个多功能酶，具有以下活性：它是一个多功能酶，具有以下活性： 53聚合活性；聚合活性； 35外切活性（校

12、对活性）；外切活性（校对活性）； 53外切活性（只作用于双链外切活性（只作用于双链DNA）；）； 从从3端使端使DNA链发生焦磷酸解（聚合反应的逆反链发生焦磷酸解（聚合反应的逆反应）；应）； 无机焦磷酸盐与无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。之间的焦磷酸基交换。25大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段 用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶，得到，得到C端端324928氨基酸残基氨基酸残基的片段，称为的片段，称为Klenow片段。片段。1-323氨基酸残基为氨基酸残基为小片段。小片段具有小片段。小片段具有53外切活性，外切活性，Kleno

13、w片段具有聚合酶活性和片段具有聚合酶活性和35外切活性。外切活性。酶切位点酶切位点Klenow片段片段26Klenow片段的立体结构蓝色为模蓝色为模板链，红板链，红色为引物色为引物链。链。27Klenow片段的活性位点28DNA聚合酶的校对作用 在在正常聚合条件下，正常聚合条件下，35外切活性不能作用于外切活性不能作用于生长链；一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，生长链；一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，生长链的生长链的3末端核苷酸落入末端核苷酸落入35外切活性位点，错外切活性位点，错配核苷酸被迅速切去，然后继续进行聚合反应。配核苷酸被迅速切去，然后继续进行聚合反应。 35外切活性起着校

14、对的作用。外切活性起着校对的作用。 校对作用越强，校对作用越强，DNA复制的准确性越高。适当复制的准确性越高。适当的错配有利于发生突变，有利于物种的进化。突变率的错配有利于发生突变，有利于物种的进化。突变率太高也不利于保持物种的稳定性。太高也不利于保持物种的稳定性。29DNA聚合酶的切口平移作用30关于大肠杆菌DNA聚合酶的研究 根据对根据对各种各种DNA聚合酶在大肠杆菌细胞中的活聚合酶在大肠杆菌细胞中的活性、合成性、合成DNA的速度、该酶基因突变对的速度、该酶基因突变对DNA复制的复制的影响的研究，发现影响的研究，发现DNA聚合酶聚合酶是大肠杆菌细胞中是大肠杆菌细胞中DNA复制的主酶，而复制

15、的主酶，而DNA聚合酶聚合酶和和的功能只是的功能只是参与参与DNA损伤的修复。损伤的修复。31大肠杆菌中3种DNA聚合酶性质的比较项项 目目聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶53聚合酶活性聚合酶活性35外切酶活性外切酶活性53外切酶活性外切酶活性相对分子量（相对分子量（103）1031038888830830一个细胞内分子数一个细胞内分子数400400？10102020生物学活性生物学活性1 10.050.051515聚合速度（核苷酸聚合速度（核苷酸/分）分）10001000200020002 2,4004001515,0000006060,000000持续合成能力持续合成能力3 32002

16、001 1,500500 500500,000000功能功能切除引物，修复切除引物，修复修复修复复制复制32大肠杆菌DNA聚合酶亚基亚基分子量分子量亚基数目亚基数目亚基功能亚基功能132,0002聚合活性聚合活性27,000235外切校对活性外切校对活性10,0002组建核心酶组建核心酶71,0002核心酶二聚化核心酶二聚化52,0002依赖依赖DNA的的ATP酶，形成酶，形成复合物复合物35,0001可与可与亚基结合，形成亚基结合，形成复合物复合物33,0001形成形成复合物复合物15,0001形成形成复合物复合物12,0001形成形成复合物复合物37,0004两个两个亚基形成滑动夹子，以提

17、高酶亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力的持续合成能力33DNA聚合酶全酶的结构与与结合结合两个两个亚基各亚基各催化复制叉处催化复制叉处一条链的合成。一条链的合成。34二聚体的滑动夹子结构红、绿色各为一个红、绿色各为一个亚基亚基35DNA聚合酶和 DNA聚合酶聚合酶和和是在是在1999年才被发现的。年才被发现的。它们的功能是进行易错修复。它们的功能是进行易错修复。36DNA连接酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶可以连接切口和粘性末连接酶可以连接切口和粘性末端，端，T4噬菌体噬菌体DNA连接酶除可以连接切口和粘连接酶除可以连接切口和粘性末端外，还可以连接平末端。性末端外，还可以连接平末端。（D

18、NA ligase）37DNA的连接类型38（四）DNA的半不连续复制39DNA的半不连续复制 在复制叉处，两条新生链是同时合成的，新在复制叉处，两条新生链是同时合成的，新生链延伸的方向一条是生链延伸的方向一条是53，而另一条是，而另一条是35，这就不符合，这就不符合DNA聚合酶催化反应的性质。聚合酶催化反应的性质。为了解决这个矛盾，日本学者冈崎等提出了为了解决这个矛盾，日本学者冈崎等提出了DNA的不连续复制模型，认为的不连续复制模型，认为35走向的新生走向的新生DNA链实际上是由许多链实际上是由许多53方向合成的片段连方向合成的片段连接起来的。接起来的。40DNA复制叉处的前导链和滞后链 5

19、3链是连续合成的，链是连续合成的， 35链是不连续链是不连续合成的，因此称为半不连续复制。合成的，因此称为半不连续复制。41冈崎片段的发现 1968年，冈崎等用年，冈崎等用3H-脱氧胸苷标记脱氧胸苷标记T4噬菌体感噬菌体感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标记的记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子，最初出现的片段，接着出现较大的分子，最初出现的DNA片片段的长度约为段的长度约为1000个核苷酸左右，这种片段称为冈崎个核苷酸左右，这种片段称为冈崎片段（片段（Okaz

20、aki fragment）。用）。用DNA连接酶变异的温连接酶变异的温度敏感株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，有度敏感株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，有大量大量DNA片段积累。这些实验都说明在片段积累。这些实验都说明在DNA复制的过复制的过程中，首先合成较短的片段，然后再由连接酶连接成程中，首先合成较短的片段，然后再由连接酶连接成大分子大分子DNA。42发现冈崎片段的实验发现冈崎片段的实验43原核生物和真核生物的冈崎片段 细菌细菌的冈崎片段长度为的冈崎片段长度为10002000个核苷个核苷酸，相当于一个顺反子（酸，相当于一个顺反子（cistron）的长度；真）的长度；真核生物的冈崎片

21、段长度为核生物的冈崎片段长度为100200个核苷酸，个核苷酸，相当于一个核小体相当于一个核小体DNA的长度。的长度。44DNA复制中的引物 由于由于DNA聚合酶必须在已有的核酸链的聚合酶必须在已有的核酸链的3-羟基上羟基上延伸新链，所以在前导链合成开始时以及滞后链的每延伸新链，所以在前导链合成开始时以及滞后链的每一个冈崎片段开始时都需要有引物。一个冈崎片段开始时都需要有引物。 RNA聚合酶以聚合酶以DNA为模板合成为模板合成RNA的过程称为的过程称为转录，转录是不需要引物的。转录，转录是不需要引物的。DNA复制的引物就是小复制的引物就是小片段的片段的RNA，这个，这个RNA引物的合成是由引物合

22、成酶催引物的合成是由引物合成酶催化合成的。化合成的。RNA引物的长度通常为几个核苷酸至十几引物的长度通常为几个核苷酸至十几个核苷酸。个核苷酸。45（六）DNA复制的过程DNA ligase DNA polymeraseOld Okazaki fragmentOkazaki fragmentPrimerLagging strand templatePrimerHelicase/primaseNewly synthesized leading strandDimeric replicative DNA polymerasesubunit“ sliding clamp”SSBLeading stra

23、nd templateDNA gyraseDNA复制叉处的结构复制叉处的结构Primer46DNA复制时涉及的部分酶和蛋白质Gyrase：拓扑异构酶：拓扑异构酶，旋转酶。，旋转酶。 Helicase：解旋酶。：解旋酶。SSB（single-stranded DNA binding protein）：）： b单链单链DNA结合蛋白。结合蛋白。Primase：引发酶，引物合成酶。引发酶，引物合成酶。Primer：引物。引物。 47拓扑异构酶 拓扑异构酶可以拓扑异构酶可以改变改变DNA双螺旋的连环数，其双螺旋的连环数，其功能是引入超螺旋或解开超螺旋。功能是引入超螺旋或解开超螺旋。 拓扑异构酶可拓扑异

24、构酶可分为两类：类型分为两类：类型的酶能使的酶能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需提供能量；的一条链发生断裂和再连接，反应无需提供能量；类型类型的酶能使的酶能使DNA的两条链同时发生断裂和再连的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由接，当它引入超螺旋时需要由ATP提供能量。提供能量。48拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶属于类型属于类型。它只能消除负超螺。它只能消除负超螺旋，对正超螺旋不起作用。旋，对正超螺旋不起作用。 拓扑异拓扑异构酶在使构酶在使DNA的一条链断裂时，由于酶的一条链断裂时，由于酶与与DNA结合，结合，DNA链不能自由转动，超螺旋的扭曲链不能自由转动，超螺旋的

25、扭曲张力不会自动消失。但是酶分子可牵引另一条链通张力不会自动消失。但是酶分子可牵引另一条链通过切口，然后使断链重新连接起来，从而改变过切口，然后使断链重新连接起来，从而改变DNA的连环数和超螺旋数。的连环数和超螺旋数。49拓扑异构酶 拓 扑 异 构 酶拓 扑 异 构 酶 属 于 类 型属 于 类 型 ， 又 叫 旋 转 酶， 又 叫 旋 转 酶（gyrase）。它可连续引入负超螺旋，反应需要消）。它可连续引入负超螺旋，反应需要消耗耗ATP。在无。在无ATP存在时，它可以松弛负超螺旋，存在时，它可以松弛负超螺旋，但不作用于正超螺旋。但不作用于正超螺旋。 大肠杆菌旋转酶由两个大肠杆菌旋转酶由两个A

26、亚基和两个亚基和两个B亚基组成，亚基组成，A亚基是抗萘啶酮酸和奥啉酸的作用位点，亚基是抗萘啶酮酸和奥啉酸的作用位点，B亚基是亚基是抗香豆霉素抗香豆霉素A1和新生霉素的作用位点。这些抗生素和新生霉素的作用位点。这些抗生素均能抑制均能抑制DNA复制，因而推测旋转酶对复制，因而推测旋转酶对DNA复制是复制是必需的。必需的。50旋转酶的作用机制 喹 诺 酮喹 诺 酮类 抗 生 素类 抗 生 素（左氧氟沙（左氧氟沙星、环丙沙星、环丙沙星和诺氟沙星和诺氟沙星 （ 氟 哌星 （ 氟 哌酸）酸）是人工是人工合成萘啶酸合成萘啶酸衍生物，它衍生物，它们是通过抑们是通过抑制制DNA旋转旋转酶的活性来酶的活性来杀死细

27、菌的。杀死细菌的。 51解旋酶（helicase） 解旋酶解旋酶能将能将DNA两条链解开，每解开一对碱基，两条链解开，每解开一对碱基，需要水解需要水解2分子分子ATP。大肠杆菌有许多种解旋酶，其。大肠杆菌有许多种解旋酶，其中解旋酶中解旋酶、可以沿着模板链的可以沿着模板链的53方向方向移动，而移动，而rep蛋白则沿着蛋白则沿着35方向移动。过去认为方向移动。过去认为在在DNA复制中，这两种酶配合作用解开复制中，这两种酶配合作用解开DNA双链，双链，但上述酶经诱变并不影响但上述酶经诱变并不影响DNA的复制。的复制。52DnaB蛋白 曾经分离出一些大肠杆菌曾经分离出一些大肠杆菌DNA复制的温度敏复制

28、的温度敏感突变株。其中一株当培养温度由感突变株。其中一株当培养温度由30升高到升高到40时，时，DNA复制立即停止，分析表明复制立即停止，分析表明dnaB基因发生基因发生了温度敏感突变。该基因产物了温度敏感突变。该基因产物DnaB是一种解旋酶，是一种解旋酶，可沿可沿DNA链链53 方向移动，由方向移动，由ATP提供能量。这提供能量。这就证明该解旋酶参与就证明该解旋酶参与DNA的复制。的复制。53单链DNA结合蛋白 大肠杆菌的单链大肠杆菌的单链DNA结合蛋白（结合蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）由）由4个相同的亚基组成，个相同的亚基组成，它的

29、功能是与已经解开的单链它的功能是与已经解开的单链DNA结合，阻止重新结合，阻止重新形成双链，保护单链部分不被核酸酶降解。形成双链，保护单链部分不被核酸酶降解。 原核生物的原核生物的SSB蛋白与单链蛋白与单链DNA的结合有正协同的结合有正协同效应，当第一个效应，当第一个SSB蛋白结合后，后面的蛋白结合后，后面的SSB蛋白的蛋白的结合力可提高结合力可提高103倍。因此一旦结合反应开始，全部倍。因此一旦结合反应开始，全部单链单链DNA迅速被迅速被SSB覆盖。但真核生物的覆盖。但真核生物的SSB蛋白没蛋白没有这种协同作用。有这种协同作用。54大肠杆菌染色体oriC的结构55DNA复制的起始超螺旋模板超

30、螺旋模板起始起始复合物复合物DnaA tetramersApproaching binding sitesDnaA tetramerOn binding sites13-bp segments 9-bp segments20-40 moreDnaA monomersWrapped DnaA-rich region of oriCHU、ATP56DNA复制起始时RNA聚合酶及HU蛋白的作用At least two other factors participate in open complex formation at oriC. The first of these is RNA polym

31、erase. This enzymne does not serve as a primase, as it does in M13 phage replication, but it still serves an essential function. We know the RNA polymerase product does not serve as a primer because we can terminate it with 3-dATP, which lacks the 3-hydroxyl group essential to a primer, and priming

32、still occurs. But we know RNA polymerase action is required, because rifampicin blocks primosome assembly. The role of RNA polymerase seems to be to synthesize a short piece of RNA that creates an R-loop. The R-loop can be adjacent to oriC, rather than within it. The second factor is HU protein. Thi

33、s is a small basic DNA-binding protein that can induce bending in double-stranded DNA. This bending, together with the R-loop, presumably destabilizes the DNA double helix and facilitates melting of the DNA to form the open complex.57DNA复制的起始开放开放复合物复合物DnaB6DnaC6hexamersDnaCsubunitsDnaBsubunitsOpen o

34、riC regionDnaT58DNA复制的起始DnaB有解旋有解旋酶活性，它每酶活性，它每解开一个碱基解开一个碱基对需要消耗对需要消耗2个个ATP。预引发预引发复合物复合物SSB binds to single-stranded regionsUnwrappingOf DnaA-richregionSSB tetramersDnaBsubunitDnaBsubunitOpen regionPriming andreplication59DNA复制体的装配DnaB complexDnaB complexEnd of oriCDnaAtetramerdisplacedDnaAtetramerdi

35、splacedPrimasePrimosomeSSB tetramer onSingle-strand DNAPrimase, PriA, PriB, PriCPriB, PriC60DNA复制体的装配RNA primerleading strandRNA primerlagging strandRNA primerleading strandRNA primerlagging strandDnaAtetramerdisplacedDnaAtetramerdisplaced61DNA复制体的装配DNApolymerase holoenzymeDNApolymerase holoenzymeLa

36、st DnaAtetramerdisplaced62岗琦片段的连接DNA polymerase DNA ligase63DNA连接酶催化的反应64DNA复制叉的延伸65DNA复制叉的延伸66DNA复制叉的延伸67DNA复制的终止 Ter位点是一个位点是一个20bp的短序列，其中含有一个保守核心的短序列，其中含有一个保守核心GTGTGTTGT，Tus蛋白与蛋白与Ter位点结合后起终止复制叉前位点结合后起终止复制叉前进的作用。进的作用。68DNA复制的终止DNA topoisomerase 69replication factory70染色体的分配71（七）真核生物DNA的复制 真真核生物染色体有

37、多个复制起始点。核生物染色体有多个复制起始点。 5-氟脱氧氟脱氧尿苷是细胞内胸腺嘧啶核苷酸合成的抑制剂，用尿苷是细胞内胸腺嘧啶核苷酸合成的抑制剂，用5-氟脱氧尿苷处理真核生物的培养细胞可以抑制氟脱氧尿苷处理真核生物的培养细胞可以抑制DNA复制，随后加入复制，随后加入3H-脱氧胸苷就可以使脱氧胸苷就可以使DNA复制同复制同步化。复制进行大约步化。复制进行大约30分钟，然后制成分钟，然后制成DNA的放射的放射自显影图像，在电子显微镜下观察，可以看到很多自显影图像，在电子显微镜下观察，可以看到很多复制眼，每个复制眼都有独立的起点，并呈双向延复制眼，每个复制眼都有独立的起点，并呈双向延伸。通过测量和换

38、算，可以估算出复制子的大小。伸。通过测量和换算，可以估算出复制子的大小。72真核生物的复制子 哺乳动物的复制哺乳动物的复制子大多在子大多在100200kb之间。之间。人的细胞有人的细胞有23对染色体，单倍体基因组大约有对染色体，单倍体基因组大约有310 9 bp，平均每个染色体有，平均每个染色体有1000个复制子。个复制子。果蝇或酵母的复制子较小，平均为果蝇或酵母的复制子较小，平均为40kb。73真核DNA的复制速度 真核真核生物生物DNA的复制叉移动速度比原核生物慢。的复制叉移动速度比原核生物慢。大肠杆菌大肠杆菌DNA复制叉的移动速度为复制叉的移动速度为50,000bp/min，哺 乳 类

39、动 物 复 制 叉 的 移 动 速 度 仅 为哺 乳 类 动 物 复 制 叉 的 移 动 速 度 仅 为 1 0 0 0 3000bp/min。但因真核细胞染色体有许多复制起始。但因真核细胞染色体有许多复制起始点同时起始复制，所以总的复制速度并不慢。点同时起始复制，所以总的复制速度并不慢。74哺乳动物的DNA聚合酶DNA聚合聚合酶酶()DNA聚合聚合酶酶()DNA聚合聚合酶酶(M)DNA聚合聚合酶酶()DNA聚合聚合酶酶()定位定位细胞核细胞核细胞核细胞核线粒体线粒体细胞核细胞核细胞核细胞核亚基数目亚基数目41221外切酶活性外切酶活性无无无无35外切酶外切酶35外切酶外切酶35外切酶外切酶引

40、物合成酶活性引物合成酶活性有有无无无无无无无无持续合成能力持续合成能力中等中等低低高高有有PCNA时高时高高高抑制剂抑制剂蚜肠霉素蚜肠霉素双脱氧双脱氧TTP双脱氧双脱氧TTP蚜肠霉素蚜肠霉素蚜肠霉素蚜肠霉素功能功能引物合成引物合成修复修复线粒体线粒体DNA合成合成核核DNA合成合成修复修复PCNA：proliferating cell nuclear antigen，增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原 DNA聚合酶聚合酶先合成一段约先合成一段约10个核苷酸的个核苷酸的RNA引物，再加上引物，再加上1020个脱个脱氧核糖核苷酸，作为氧核糖核苷酸，作为DNA聚合酶聚合酶 的引物。的引物。75细菌和真核生

41、物复制体的组成组组 成成细细 菌菌真核生物真核生物复制酶复制酶DNA聚合酶聚合酶全酶全酶DNA聚合酶聚合酶进行性因子进行性因子夹子夹子PCNA定位因子定位因子复合物复合物RF-C引物合成酶引物合成酶BnaGDNA聚合酶聚合酶去除引物去除引物RNase H和和DNA聚合酶聚合酶RNase H1和和MF-1滞后链修复滞后链修复DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶连接酶解旋酶解旋酶DnaB（定位需要（定位需要DnaC）T抗原抗原消除拓扑张力消除拓扑张力旋转酶旋转酶拓扑异构酶拓扑异构酶单链结合单链结合SSBRP-A76PCNA同源三聚体夹子77真核染色体末端的复制 对于线性对于线性DNA的复制，两条新链的复制，两条新链5末端的引末端的引物切除后出现缩短现象，这种现象会使染色体不物切除后出现缩短现象，这种现象会使染色体不稳定。稳定。78真核染色体末端的复制 为了解决这个问题，染色体的两端有一段特殊为了解决这个问题，染色体的两端有一段特殊序列，称为端粒（序列，称为端粒（telomeres）。端粒由许多短序列）。端粒由许多短序列的串联重复组成。原生动物四膜虫端粒的重复序列的串联重复组成。