Ames试验的发光测定法——细菌回复突变试验

1、蓝色海洋书的海洋ames试验的发光测定法细菌回复突变试验 1原理 将发光细菌的荧光酶基因（luxgenes）转入ames实验用的几种菌株中，使它们获得合成细菌荧光酶的能力，从而像发光细菌那样也会产生蓝绿色荧光。细菌荧光酶催化的发光反应如下：细菌荧光酶fmnh2脂肪醛+o2fmn+h2o脂肪酸十可见光其中fmnh2是还原型黄素单核。这是典型的生物发光。ames实验用的鼠伤寒沙门氏菌（his-）各个菌株，在具有了lux基因之后，就可在细菌细胞内合成荧光酶。但其细胞内尚缺少发光底物脂肪醛，故而必需人为加入脂肪醛后才可产生发光反应。本办法要求添加癸醛溶液。已知发光强度与细菌数量呈线性关系，细菌数量越多

2、则发光越强。发光的强度可以用发光仪检测。因为必需发生回复突变方能生长，故回复突变的菌越多，则发光越强，故可以用来估测回复突变的数量。更因为发光仪有足够的敏捷度，对极小的发光变幻均可检测出来，故而本办法的敏捷度较好。与通常的ames实验相比，因为不用平皿菌落计数，而代之以发光强度的检测，故可使操作容易得多，而且获得结果的时光也较快。2样品的采集与保存3样品处理简言之，固体物应配成溶液，而水样则应举行适当的浓缩或吸附。4仪器设备仪器：发光检测仪。原则上生物化学测光仪均可以用法。为检测便利，建议采纳其样品室可一次放入多个试样，一次启动延续可自动检测多个样品的发光仪。设备条件：同ames实验。5受试生

3、物材料1）供试菌株有四株，分离为lz12,lz14,lz17,lz18，它们与常规ames实验的菌株对应如表。特殊指出的是，它们也均可作为常规ames实验菌株加以用法。2）菌株保存：参见受试生物部分。3)菌株的基因型性质鉴定：ames实验所规定的几个鉴定：a)组氨酸依靠性；b)r因子鉴定：c)紫外线照耀实验（(uvrb缺失突变鉴定）；d)结晶紫敏感性实验（rfa突变鉴定）；e)自发回变率鉴定；参见受试生物部分。发光基因（lux基因）鉴定：在养分肉汤培养基中加入氯霉素，使终浓度为25g/ml。接入对数期的待测菌株的培养物，37培养24h，取lml培养的菌液，加入测量杯中，加入501癸醛液，充分混

4、匀置测光仪中检测发光。同时用空白肉汤培养基也加入癸醛液作为空白对比。当发光基因存在并获得表达而产生足量的荧光酶时，则发光计数非常显著，可以是空白对比的十余倍或千余倍。此时，菌株才可以用于实验。6实验程序(1)普通样品的检测增菌：用接种针挑取少量菌苔接种于50ml的培养基中（含氨苄青霉素和氯霉素终浓度均为25g/ml。但对菌株lz18则为四环素和氯霉素，终浓度分离为2gg/ml和25g/ml),37振摇200r/min过夜。取l0ml菌液接入100m1肉汤培养基中，继续振摇2-3h，使培养物保持对数期生长。清洗及重新悬浮细菌：上述培养好的菌液于4,5000r/min离心10min，弃去上清液，以

5、基本葡萄糖培养基清洗两次，再重新用基本葡萄糖培养基（含少量组氨酸和生物素，终浓度约为0.045mmol/l)悬浮细胞，并使光密度od660=0.2。将样品以倍比稀释为五个浓度，成为五个试样，逐步加入各个组分。将上述总体积为8.8ml的空白对比及试样（有五个浓度），分装于小试管中，每管lml。每列可得8个平行重复的样品。于37100r/min振摇培养36-48h。4,5000r/min离心，去除上清液，用1ml无组氨酸的基本培养基重新悬浮细胞。测试发光强度：在上列每个试管中加入50l癸醛，充分混匀。应特殊注重加入癸醛后1-2min时检测发光值。因为发光随时光而可能变幻，故同一实验中应取统一的作用

6、时光而读取发光值。建议在加入癸醛后lmin时读取发光值。测试温度25。此温度是荧光酶的最适温度。(2）需添加s-9液的发光ames实验增菌，同6(1)。清洗及重新悬浮细菌，同6(1)。将样品以倍比稀释成五个浓度，成为五个试样。温育预处理：将样品、菌液和s-9液充分混合，37温育8-10h。4离心(3000r/min)，去掉上清液，以基本培养基清洗1次。条件同上，以去除s-9液。然后再以基本培养基重新悬浮细菌，使体积为2.5ml，再加入表5-4-6中的其余组分，混合匀称。将上述混合液分装于小试管中，每管lml，每列有八个重复平行管。于37,100r/min振摇培养36-48h。4离心（5000r

7、/min)，弃上清液，用lml无组氨酸的基本培养基重新悬浮细胞。测试发光强度：在上列试管中加入50l癸醛充分混匀，在每管加入癸醛后约lmin时读取发光值。质量保证与质量控制（1)关于检测的质量因为以发光值来取代菌落计数，发光值虽在一定条件下与菌数呈线性关系。但因为测试发光是在一定时光的回复突变发生之后举行的，一个回复突变菌可因繁殖而增强，从而使发光值升高，回复突变发生得越早，则其产生后代越多，发光值增强也越多。所以可以设想同样两个回复突变菌，因为发生的时光早晚不同，其所贡献的终于发光值两者差别是很大的，这不利于回复突变的对应计数。本实验按波动实验设计，对同一检测设置8个平行重复管，最后取八个重

8、复管的平均值。空白对比和样品均如此，从而消退其波动影响。关于添加s-9液的实验：s-9液的添加可以使ames实验检出某些潜在的诱变剂，即需代谢激活的诱变物质。在本实验中因为发光检测的特别性，不能采纳容易加入s-9液的方式，而是要用预先温育8-10h，使s-9液与试样中的潜在的诱变物质作用之后，再洗去s-9液，然后再摇床培养，测定发光。诱变结果，可以通过发光值与样品浓度之间的关系曲线推断（见8(2)。(2）检测条件1)温度：25。此为荧光酶催化发光反应的最适温度。因为大大低于细菌生长温度37，故可以削减细菌的增殖，从而减小发光值的波动。2）癸醛溶液：凡长链脂肪醛(8c以上）均可使细菌荧光酶发光。

9、本办法规定用癸醛，并以2g/100m1（癸醛：水）混匀后，以超声波处理，使之成为稳定的乳浊液后方可用法。规定lml受试样品中加入50l癸醛，终浓度约为lmg/ml。过高浓度的醛会有毒害作用，反而使发光下降。3）几种主要的培养基配方。养分肉汤培养基（增菌用）：组分：牛肉膏 5g蛋白胨 l0gnacl 5gk2hpo4 1g蒸馏水 加至1000mlph7.0-7.2 121灭菌15min基本培养基（或称基本葡萄糖培养基）：组分：50×vb盐20m1（已灭菌的）40%葡萄糖50ml(110，灭菌l0min)蒸馏水930ml(121，灭菌20min)用法前将各组分充分混匀。50×v

10、b盐：组分：硫酸镁（mgso4·7h2o) l0g柠檬酸（c6h8o7·h2o) 100g磷酸氢二钾（k2hpo4) 500g磷酸氢按钠（nanh4hpo4) 175g将670ml蒸馏水放入2l的大烧杯中，在磁力搅拌器上加热到45，按上述挨次加各种组分，要求在一种溶解之后再加后一种，待彻低溶解后加水至1000ml。分装后，121灭菌20min。冷却后置4冰箱备用。含有少量组氨酸一生物素的基本培养基（致突变实验用）：组分：基本葡萄糖培养基 100m1 0.5mmol/l组氨酸一生物素 l0ml 临用前充分混匀。0.5mmol/l组氨酸一生物素添液（致突变分析用）：组分：d-生

11、物素（分子量247.3)30.9mgl-组氨酸hcl（分子量197.1)24mg蒸馏水250m1生物素需加热才干充分溶解。配好的溶液在121，灭菌20min。8数据与报告（1)数据处理相应的发光值可按表5-4-7记录。作剂量与发光强度关系曲线图：对上述平均值，依发光值为纵坐标，试样五个浓度为横坐标，作出曲线，从而可以推断是否存在量效关系。(2）结果评价量效关系评价：ames实验规定，同一受试物有三个以上浓度引起的回变菌落数对空白对比有显然增强，且存在量效关系，即可判定受试物为阳性。依此为据，本办法规定：若受试物有三个以上浓度的平均发光值显著大于空白对比组（添加s-9的实验以溶剂组发光值对比），且存在量效关系，可判定该受试物为阳性。明确地说，按ames法的回变率计算：回复突变率(mr)=诱变菌落平均数皿（(rt)/自发回变菌落平均数皿（(re）当mr 2，阳性本办法依据发光值与菌数呈正比的原理，将发光值代替上式中的菌落数，计算mr值：回复突变率（mr）=样品发光平均值/空白对比（或溶剂对比）发光平均值当mr 2，阳性同时也应按ames实验之原则，用已知诱变剂作为阳性对比。惟独在用已知诱变剂作为阳性对比的结果确为阳性时，实验的结果才干认定有效，否则应重新实验。