EGFP的原核表达分析

1、EGFP 的原核表达分析首都师范大学生命科学学院100048摘要：利用 PCR反应扩增出所需要的BL21,提取质粒，诱导 EGFP 蛋白表达，进行进 做检测。这个实验让我们充分熟悉了整个流程。 关键词：绿色荧光蛋白蛋白的诱导表达、分离纯化材料和方法：1、主要材料及仪器1.1、菌株和质粒：大肠杆菌 BL21为本实验 室保存；重组筛选质粒 pTrcHis 购自 Invitroge公司。1.2、培养基：LB 培养基（液/固）内含氨节 青霉素浓度为 100 ug/ml。1.3、器材和试剂器材：移液枪、 PCR仪、离心机一（HetticZENTRIFUGEND-78532 Tuttlingen ）、 S

2、IGMA2-16K（4 C 离心机）、 SIGMA 3-18K（离50ml 大离心 管）、紫外透射观察仪、水浴锅、 核酸电泳仪（BIO-RAD ）、超声 波破碎仪（SONICSVIbracell ）、气浴恒温振荡器（THZ-82江苏 金坛市金城国胜实验仪器厂） 、SDS-PAGE电泳装置、Western Blotting电转移装置、水平摇床（ WD-9405 ） 、 胶 片 观 察 灯（WD-9406） 、 封口机、 超净台、250ml锥形瓶。试剂：PCR 反应体系缓冲液（1050 mMTris-HCl , 50 mM KCl , 1.5 mMMgCl2） 、 DNA 聚合酶 （Taq E）

3、、 dNTPs混合物（每种 2.5mM ）、 博大泰克PCR产物快速回收试 剂盒、限制性核酸内切酶（BglII、 EcoRI）、0.5MEDTA、琼脂糖凝 胶（1g 琼脂糖、100ml1xTAE、 10ulEB ）、电泳缓冲液（50 x TAE、Tris乙酸、EDTA ）、漠 酚兰、蔗糖、甘油、连接酶（购 于Promega公司的 T4DNA 连接表达蛋白检测E.coli酶 及10 x ligation buffer ） 、0.1MCaCl2、 碱裂解液 （溶液I： 50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl , pH=8.0、10mM EDTA ; 溶 液II : 0.2 MNaOH , 1%

4、 SDS;溶液 III : 5 M KAc ,11.5 ml 冰 醋 酸 ， 加 水定 容 至100ml）、RNaseA、无水 乙醇、PBS缓冲液、裂解缓冲液（含 20mM 咪哩）、冲洗液（含100mM 咪哩）、洗脱液（含 500mM咪哩）、5X样品缓冲液、 30%凝胶贮液、4 X分离胶缓冲 液、4X 浓缩胶缓冲液（4C保 存）、TEMED 原液、10%过硫酸 铉、Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3 ）、考马斯亮蓝 G250染色液、GFP抗体（200ug/ml , 用pH=7.5 TBS 配置）、转移缓冲 液、TBS、封闭液（5%脱脂奶粉）、 显色液 （氯荼酚， 30mg/ml 于甲 醇

5、中） 、ddH2。 、 脱色液（ （100ml 冰乙酸:100ml 乙醇:800 ml 蒸储 水）2、方法2.1、EGFP 基因的 PCR 扩增及其电 泳检测在一灭菌的0.2mL小离心管中依次 加入（总体积为 50ml）:10 x buffer（Mg2+） 5ml4 X dNTPs（每种 2.5mM ） 8mlEGFP-F1mlEGFP-R1mlTemplate（ 模 板）34mlTaqE1mlEGFP 基因，与 pTrc His 蛋白表达载体重组，转化大肠杆菌步的分离纯化并用SDS-PAGE和 Western-blotTotalvolume50 U循环参数94 C 3min94 C 30s

6、孔55 C 30s 卜 27cycle 72 C 1min 72 C 10min4 C保存2.2、PCR扩增产物的回收- 试剂盒法1）、柱平衡：向吸附柱 CB2 中（吸附柱放入收集管中） 加入 500ml的平衡液 BL , 12000rpm离心 1分钟，倒 掉收集管中的废液，将吸 附柱 CB2重新放回收集管中。2）、上样：估计 PCR反应液，向其中加入 5 倍体积的结合液 PB，充分混匀，然后移入 吸附柱CB2 中（吸附柱放 入收集管中） ， 室温放置2 分钟， 12000rpm离心 3060秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CB2 放 入收集管中。3）、 漂洗：向吸附柱 CB2 中加入600

7、ml 漂洗液 PW（使用前 先检查是否已加入无水乙 醇），静止 2min后， 12,000rpm 离心30-60 秒， 倒掉收集管中的废液，将 吸附柱 CB2 放入收集管中。4）、漂洗：重复步骤 3。5）、 甩干： 将吸附柱 CB2 放回收集 管中，12000rpm，离心 2 分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2开盖置于室 温放置数分钟，彻底地晾 干，以防止残留的漂洗液 影响下一步的实验。6）、洗脱：将吸附柱 CB2 放入一个 干净的离心管中，向吸附 膜中间位置悬空滴加3050ml 洗脱缓冲液 EB , 室温放置 2 分钟。12000rpm离心 2分钟收集 DNA溶液。2.3、 PCR 扩增产

8、物的电泳检测PCR产物6ml6x样品缓冲液1ml混匀后加入样品孔中，100V电泳20-30 min2.4、 酶切产物的回收 - 试剂盒 法方法同 PCR扩增产物的回收2.5、 体外重组按以下比例加入试剂：10 x ligation buffer2 h载体3 UPCR片段14 kT4 DNALigase1 UTotalvolume20 pl16C 过夜。注意：最后加入载体，放入 16 C 的 锅中水浴时要注意把板子拿起来插， 以免进 水。2.6、制备感受态细胞1）、划线复壮宿主菌 37 C过夜。2）、挑一个单菌落于 30ml LB 液 体培养基中，37 C、 200rpm 至OD600=0.2

9、0.4。3）、培养液分装到预冷的无菌1.5ml Ep 管中，于冰上放置510min, 离心 4 C , 5000rpm,离心 5min。4）、弃上清，吸干残存培养液，加 1.0ml 预冷的 CaCl2 溶液 重悬菌体，冰上放置 1530min , 4C, 5000rpm , 离心 5min。5）、重复步骤 4。6）、加 100ml 冰预冷的 CaCl2 溶 液重悬菌体，放置 4 C 用于转化。2.7、 重组 DNA 转化感受态细胞1）、加 10ml 连接产物到 100ml 感 受态细胞中，轻悬以混合内含物，置于冰上 30min。2 ）、42 C 热休克 90 秒，不要摇 动试管，置冰上 1 2

10、min。3） 、加 400ml 液体培养基，37 C150rpm 摇 45 60min。4） 、 微波炉融化 LB 固体培养基， 待冷却至 50 C左右时，加入相 应的抗生素，摇匀，倒平板，每板 20ml左右。室温凝固。5） 、转化产物用无菌涂板器涂匀。6） 、37 C 倒置培养过夜。2.8、 重组质粒的提取- 试剂盒 法1）、在含有抗生素的 LB 培 养基 中接种一单菌落，37C, 150rpm摇培过夜。2）、柱平衡步骤：向吸附柱 cp3中（吸附柱放在收集管中） 加入 500ml 的平衡液 BL。12000rpm 离心 1min,倒掉 收集管中的废液，将吸附柱 重新放回收集管中。（请用 当天

11、处理的柱子）3）、取 1.5ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台 式离心 12000rpm 离心 1min 尽量吸除上清（菌液多时可 以通过多次离心将菌体沉淀 到一个离心管中） 。4）、向留有菌体沉淀的离心管中加入 250ml 的溶液 p1 （检查 是否已加入 RNaseA）,使用移 液器或者涡旋振荡器彻底悬 浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块， 会影响裂解， 导致提取量和纯度 偏低。5） 、向离心管中加入 250ml 溶液 p2,温和上下翻转 6-8次使菌体充分 裂解。注意：温和地混合，不要剧 烈震荡，以免打断基因组 DNA ,造成提取的质粒中混 有基因组DNA 片段。此时

12、菌液应清亮粘稠，所用时间 不超过 5 分钟。如果未变清 亮，可能是菌体太多，裂解 不彻底，应减少菌体量。6） 、向离心管中加入 350ml 溶液p3,立即温和上下翻转6-8次，充分混匀，此时将会出现 白色絮状沉淀。12000rpm离 心10min ,此时在底部形成沉 淀。注意：p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上 清中还有微小白色沉淀，可以离心后取 上清。7）、将上一步收集的上清液用移液器转移到 cp3中（吸附柱放入 收集管中），不能吸出沉淀。12000rpm 离心 30-60S,倒废 液，将吸附柱 cp3放入收集管 中。8）、可选步骤：向吸附柱 cp3 中加入 500ul 去蛋白溶

13、液pd,12000离心 30-60S,倒废液，将吸附柱 cp3重新放回收集 管中。如果 宿 主 菌 是endA+菌（TG1,BL21,HB101,JM 系 列，ET12567等），因为有核 酸酶，推荐采用此步骤。若不是，可省略。9）、向吸附柱 cp3 中加入 600ul 的 pw（用前加入无水乙醇），12000rpm 离心 30-60S,倒废 液，将 cp3放回。10） 、重复步骤 9。11） 、将吸附柱 cp3 放入收集管中，12000rpm离心 2min， 除去残 余漂洗液。注意：此步非常重要，建议 cp3开盖放置数分钟，以彻 底晾干。12）、将吸附柱 cp3 置于一个干净 离心管中，向其

14、中间滴加 40ml的洗脱缓冲液 EB,室 温放置 2min,12000rpm 离 心 1min，将质粒溶液收集到 离心管中。2.9、大肠杆菌中重组蛋白的表达和纯（a）蛋白的诱导表达1）、挑取含重组质粒的单菌落，接种于含 Amp 抗生 素的培养基中（终浓度 100mg/ml） , 37 C 振荡培 养过夜。2）、次日以 5%量接种，37 C培养至 OD = 0.6 时，加入IPTG（终浓度为 1mM ） , 37C诱导表达 2 3h.3）、收集细菌（每组 20ml）,5000rpm 离心 10min, 20 C 保存。（b）大肠杆菌细胞的破碎1）、收集细菌（每组 20ml）,5000rpm 离心

15、 10min。2）、取出保存的细菌，加入1ml 裂解缓冲液，充分 混匀后再加入溶菌酶 ， 使得终浓度为 1 mg/ml, 放置冰浴中 3060min 充分酶解。3） 、冰上用超声波（200 一300W）破碎细胞，每次 10秒，间歇 10秒，共做 6次。4）、11000 rpm4C离心 15一20min ,收集上清液。5）、取 20ml上清液，-20 C暂存，准备进一步做SDS-PAGE分析。其余 上清液做下一步亲和纯 化。（c）融合蛋白的亲和层析1）、结合：1ml 裂解液加入50ml Ni-NTA 填料用涡旋振荡 器（200rpm） 混 合均匀，4C, 60分钟。2）、装柱：将上述混合液装 入

16、准备好的层 析柱，打开层 析柱出口，让 液体自然流 过。3）、冲洗：待液体流尽以后，自层析柱 顶部徐徐加入 1ml冲洗液，让 液体自然流 尽。重复此步 骤 1 次。4）、洗脱：自层析柱顶部缓慢加入 0.1ml洗脱液，收集流过的液 体，即获得洗 脱的蛋白。重 复此步骤 1次，每次分别 收集蛋白洗脱 液。（d）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1） 、将玻璃板、样品梳、Spacer 用洗涤剂洗净，用ddH2O 冲洗数次， 再用乙醇擦拭，晾干；2）、制胶架3) 、检查凝胶板是否渗漏4 )、制胶(1) 、按如下体积配制10%分离胶 8 ml,混匀；ddH2O3.4 ml4X分离胶缓冲 液2.0 ml30% Ac

17、r-Bis2.6 ml10%AP50lTEMED5l(2) 、向玻璃板间灌制分离胶，立即覆 一层重蒸水， 大 约 20min 后胶即 可聚合；(3) 、按如下体积配制6%浓缩胶 4.0 ml,混匀；ddH2O 4X 浓缩 30% Acr-Bis 10%AP2.3ml700l50l5l(4) 、将上层重蒸水倾 薯制浓缩胶，插入样品梳；注意：操作时要 带手套， 灌胶时不 能有气 泡，以免 电泳时影 响电流通 过。(e)Western Blot1 )、滤纸和硝酸纤维素薄膜的准备切 4张滤纸和 1张硝 酸纤维素滤膜(避免 用手直接接触滤膜， 需带手套操作)， 其大 小都应与凝胶大小吻 合，放入浅盘中，

18、并 加入转移缓冲液使其 浸泡 15-20min。2)、凝胶-硝酸纤维素薄膜 二明治”的制作(1 )、打开转移盒并放 置在浅盘中，用转 移缓冲液将海绵 垫完全浸透，海绵 的上面放置2张用 转移缓冲液浸泡 过的滤纸；(2) 、小心将凝胶用去离子水略为漂洗一下， 然后放在滤纸 上，要保证精确对 齐，避免气泡；(3) 、以转移缓冲液润湿胶面，小心将硝酸 纤维素薄膜准确 平放于凝胶上。从 凝胶一边开始轻 轻放下，可避免气 泡；(4 )、在硝酸纤维素薄 膜上放 2张润湿的 滤纸，用一玻璃移 液管作滚筒轻轻 滚过凝胶-硝酸纤 维素薄膜芭明治”以挤出所有气泡。(5)将另一块海绵垫用 转移缓冲液完全 浸透后，放

19、在凝胶 -膜竺明治”上， 关上转移盒并插 入转移池。以上各 步接触凝胶和薄膜时，均需带手 套。转移缓冲液最 好预冷，并且在转 移槽的冰盒中放 入冰避免转移过胶缓冲液TEMED1ml去，滤纸吸干,程中产生大量的 热。3） 、 电转移： 倒满转移缓 冲液，稳压 100V转移 1h。（f）免疫检测1）、封闭：关闭电源， 拆下转移 装置， 用镶子把硝酸 纤维素薄膜放入可 加热封口的塑料袋 中， 根据滤膜面积以 0.1 ml / cm2的量加 入封闭液（约8ml）, 尽可能排除里面的 气泡，然后密封袋口， 平放在平缓摇动 的摇床上于室温温育 3060min。应保 证薄膜与封闭液充 分接触。2）、洗膜：倒

20、掉封闭液， 用 TBS 洗膜三次。3）、加入抗体：将封闭过的硝酸纤维 素薄膜放入另一个塑 料袋中，按薄膜面积 0.1 ml/cm2（约 8ml）加入稀释的 EGFP抗 体，小心除去气泡，密 封袋口，平放在摇床上 室温温育 1 h 或过夜。4）、洗膜：将薄膜转移至盛有 TBS的培养皿中，于 室温平缓摇动，漂洗 5 6min ,重复 2次。5）、显色：将薄膜转移至盛有显 色液的培养皿中，细 心观察反应过程。一 旦蛋白带 的 颜 色 达 到要 求（5-30min）,即取 出滤膜，用去离子水 漂洗 3次，每次 10min。将薄膜用吸水 纸吸干水分，记录条 带位置，拍摄照片，留作永久实验记录。拍摄应在一

21、周内进 行，因为随着时间推 移，条带会变浅， 薄 膜会变黄。结果：GFPGFP 基因的 PCRPCR 产物的电泳结果 如图所示：最左边和最右边的条带均为 marker,中间分别为不同组GFP基因的PCR产物的电泳条带，有三组条带出现异 常，其余条带均为 720bpGFP基因条带。扩 增出少量目的基因，说明试剂、仪器没有问 题，可能操作有问题。而GFP基因条带周围的微弱条带是由于 pcr 中基因的非特异性 扩增。重组菌的阳性筛选如图所示：图中阳性对照中培养基长满菌， 实验组中长 了一部分菌，阴性对照组中没有菌。加有氨节青霉素的培养基能对具抗氨节青 霉素抗性进行筛选。阳性对照组中接种腭转 化的大肠

22、杆菌细胞都具有抗性，故能长满 菌；实验组中接种的一部分大肠杆菌细胞内 含有外源质粒因此具有抗性， 一部分大肠杆 菌内不含外源质粒不具抗性， 故实验组只长 了少量的菌落，阴性对照组中接种的细胞不 具抗性，故在培养基中不能生长。2.3.22.3.2 重组蛋白的亲和纯化及 SDS-PAGESDS-PAGE 检 测构建表达载体时，在 GFP 的 N端引入 6个 组氨酸标签。亲和层析柱的NTA 填料有 4个金属螯合位点，能牢固螯合 Ni2+,而 Ni2+有两个开放的互补位点可与组氨酸结合。当组氨酸与 Ni2+结合后，使得带有 His6标记 的蛋白质就受到阻滞，挂在层析柱上。利用咪哩与目的蛋白竞争金属离子

23、结合位点的 特性，通过提高洗脱液中咪哩的浓度，与 His6标记蛋白竞争 Ni2+结合位点，从而将 组氨酸标记蛋白洗脱下来。利用此原理纯化 目的蛋白 EGFP。SDS-PAGE电泳检测结果如下图： 以们第二组同学 SDS跑胶出来的结 枚果并不是很好，主要原因是刚开始 起压稍微大了一点，泳动速度太快 有达到很好的分离效果，我们下面再然后是 western 的结果图，我们组的在洗脱 脂牛奶的时候没有洗干净，再加上之前跑胶结果不是很理想， 所以条带特别浅，出现的 时间也特别慢，我们借用一组同学的结果：卜面是单独一条带（颜色比较浅）的时候了,H糟.一组同学的结果，比我们的要好很 云：重组蛋白的 WesternWestern BlottingBlotting 检测实验利用重组表达的GFP蛋白与源于小鼠的 GFP抗体结合（融