siRNA的合成方法

1、RNA 干扰(RNA interference , RNAi)是由双链 RNA(double strandedRNA, dsRNA 汾子在 mRNA 水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。dsRNA 可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。因此，RNAi 技术又被形象地称为基因敲除(knock out)或基因沉默(gene silencing)o1 RNAi 技术的发展过程早在 1990 年，植物学家 Jorgeen 等人用矮牵牛花做试验，探生网 将紫色素合成基因导入植物体，尝试将更多拷贝的色素基因注入植物体，使花朵的色 彩更加艳丽。结果许多花

2、朵没有开出更艳丽的花朵，反而开出白色的花朵。 进一步分析发现，这些转入的基因不但自身没有表达为蛋白质，反而关闭了牵牛花中与其 同源的色素相关基因的表达。由于这种由外源基因的导入而造成的抑 制作用最初被确认是发生在转录后水平，称这种现象为共抑制(cosureion)2。1994 年，Cogoni 等人将外源性类胡萝卜素基因导入野生型粗糙链抱霉菌，结果 转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制，他们称这种基因失活形式为消除作用或基因压制(quelling)3。1995年康乃尔大学的 GuS博士在实验中想 通过反义 RNAffi 断美丽线虫(C. elega)的 par-1 基因表达，同时还用正

3、义 RNA 做了一个对照，试图观察到对照试验组基因表达增强的现象，但结果却发现了反 义和正义 RNMK 阻断了 该基因的表达，Guo 等人一直不能解释该现象。直到 1998 年 Fire等5才发现这是由于 Guo 博士在试验中污染了双链 RNAW 引起的。他们 还证明转录得到的单链 RN%纯化后注射线虫所引起的阻断作用十分微弱，而经 纯化的双链 RNAM 能高效特异地阻断相应基因的表达，他们将此现象称为RNA十扰。1999 年，Hunter6等 的实验进一步验证了 RNAi 的存在。他们将 dsRNA 去除后，再将正义或反义的 RNAft 入线虫卵中，没有产生基因沉默现象。相反， 如果将上述正

4、义及反义 RNA 混合，经退火复性后得到的 dsRNAS入线虫卵中可 以显著地产生基因沉默现象，从而印证了Fire等提出的 RNAi 作用是由 dsRNA引起的结论。2000年首次在果蝇中发现，通过核糖核酸酶可将长的dsRNAft 理为 2123 nt 的短片段。2001年，首次报道了哺乳动物细胞中也有 RNAi。2002 年证明了用短的发夹结构 RNA(shRNA 在哺乳动物细胞中可以诱导特异性的基 因沉默7。 2003年首次用 RNAi 技术对模型动物进行了治疗研究8。2006年诺贝 尔医学奖没有坚持研究成果要经过数十年实践验证的“惯例”，破格授予美国科学家安德鲁？菲尔和克雷格？梅洛，以表

5、彰他们 1998年发现了 RNAi 现象。此后， 人们在不同种届的生物中进行了广泛而深入的研究，结果证实 dsRN导的 RNAi现象存在于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、涡虫、水 螟、斑马鱼、小鼠、大鼠、 猴乃至人类等多种生物中2。2 RNAi 的作用机制目前关于基因沉默的假说认为，转录后水平的基因沉默，主要包括起始阶段、效 应阶段和倍增阶段。2. 1 起始阶段外源性导入或由转基因、转座子、病蠹感染等多种方式引入双链核糖核酸(dsRNA), 在细胞内特异性与 RN硼 m (RNAas 曲核酸内切酶)Dicer结合，dsRNA切割成 2123nt 长度的带有 3端单链尾巴及磷酸化的 5端的短链 dsR

6、NA 即小十扰 RNA(siRNA (以下图片均来自于陈莉等的文章在医药领域中RNAF 扰研究进展)2.2效应阶段双链 siRNA 可以与含 Argonauto (Ago)蛋白的核酶复合物结合形成 RNAW 导沉 默复合体(RNA-induced silencing complex , RISQ 并被激活。在 ATP 供能情 况下，激活的 RISC将 siRNA 的双链分开，RISC 中核心组分核酸内切酶 Ago 负责 催化 siRNA 其中一条链去寻找互补的 mRNAl,然后对其进行切割。反义链先与 同源 mRN/K对结合，然后 RISC在距离 siRNA 3端 12 个碱基的位置将 mRN

7、AU 断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默9。2.3倍增阶段siRNA 在 RN 嵌赖性 RN 承合酶(RdRP)的作用下，以 mRN 削模板，siRNA 为引 物，扩增产生足够数量的 dsRNA 作为底物提供给 Dicer 酶，产生更多的 siRNA, 可再次形成RISC,并继续降解 mRN 戒而产生级联放大效应。并作用于靶 mRNA 如此反复倍增，从而使 RNAi 的作用进一步放大。 因此少量的 siRNA 就可以产生 高效的基因沉默效果10。3 RNAi 的设计及合成3.1 siRNA 的设计设计高效率的 siRNA首先要通过 NCBk DDBJ BMB 区 3个基因序列数据库，检 索

8、相关的基因序列，获得靶向 mRN 威 cDNAff 列，再就是合理设计 siRNA。常 规 siRNA 的设计原则是以成熟的 mRN 的标准，若以 DNAff 列为参照，则最好选 择 cDNA 专录区+50到+100 以后的 下游序列，两端的非翻译区不作为 siRNA 设计 依据。siRNA 二聚体的正义链和反义链各含 21nt 为佳，3端为突出末端。3凸 端为尿苜(U) , 5凹端为腺苜(A)的 mRN 舟列应作为首选。进行 Gen-BankBLAST 查询，确保所选 siRNA 编码不与其它基因同源11。不是 mRNAj 所有业单位都能 形成有效的 siRNA,大约有 60%7。宛以发挥沉

9、默效应，这是由于 5 和 3 -UTR 有丰富的调控蛋白结合区域，产生 UTR 结合蛋白或翻译起始复合物均可能影响 RISC 结合 mRNA 从而影响 siRNA 的效果，所以沉默效应率差异较大，针对一个 靶基因需要设计 34 条 siRNA,以保证能够筛选出一条有效序列12。3.2iRNA的合成方法制备 siRNA 的方法主要有化学合成法、体外转录法、酶消化法、体内转录法等。当已经找到最有效的 siRNA 时，适合以植苜酸单体为原料，通过化学方法合成两 条互补的长约 2123 nt的 RNAI 链，然后退火形成双链复合体，这种方法所获 得的产物纯度、十扰效率高，合成简单，但是制备周期长，作用

10、时间短，而且价 格昂贵限制了其应用和推广13。体外转录法14是以两段互补的 DN隅棋板，在 针对靶序列的正义链和反义链上游接上 T7 启动子， 使用 T7 RN麻合酶， 各自在 体外转录获得两条单链 RNA将两条单链退火后形成双链 RNA 然后用 RNAB 消 化，所得产物经纯化后就是所需的双链 RNA 此方法适用于筛选有效的 siRNA, 但不适用于对特定 siRNA 进行长期研究。酶消化法15是先在体外化学合成 2001000完整的目的基因长片段 dsRNA 用细胞内形成的 siRNA 关键酶-Dicer 酶或者 RNas由进行消化，即可得到各种不同的针对同一目的基因的不同位点的 siRN

11、A 混合物，然后将混合 物转染至细胞内，能得到较高的抑制效率。该方法 抑制率高，且省时省力，但此法产生的混合物可能导致非特异性抑制，另外在体外转录长链 RNM 困难,Dicer酶费用较高16,此方法不适用于长时间的研究 项目，或者是需要一个特定的 siRNA 进行研究，特别是基因治疗。体内转录17是将 siRNA 的质粒、病蠹表达载体或带有 siRNA 表达盒的 PCFT 物转入细胞，由 细胞表达产生 RN 时扰作用0sirna表达载体常用能在哺乳动物细胞中表达 shRNA 的含有RN麻合酶m (poim)启动子的载体18,通过转染含有 RN寐合酶II/III 的启动子 U6或 H1,及其下游一小段特殊结构的质粒或病蠹载体到宿主细胞内， 转录出 shRNA 该 RNM 细胞内被 Dicer酶剪切成 siRNA 而发挥作用。该方法的 优点是细胞特异性强，适用于基因功能的长时间研究2。siRNA 表达框(siRNAexpreion caettes , SECs)17是 一种由 PCRU 备的 siRNA 表达棋板，可直接转 入细胞进行表达而无需事先克隆到载体中。利用引物延伸法进行PCR 产生