第三章高效液相色谱分析ppt课件

1、第三章第三章 液相色谱法简介液相色谱法简介3.1高效液相色谱分析法的特点高效液相色谱分析法的特点1. 高压高压 采用高压泵使流动液能迅速经过色谱柱，采用高压泵使流动液能迅速经过色谱柱，普通达普通达150105 350 105 Pa。2. 高速高速 高压带来高速，分析时间普通少于高压带来高速，分析时间普通少于lh。3. 高效高效 柱效能约可达柱效能约可达3万塔板万塔板/米米GC的柱效约为的柱效约为2000/米。米。4. 高灵敏度高灵敏度 由于采用了高灵敏度的检测器，最小由于采用了高灵敏度的检测器，最小检丈量可达检丈量可达10-9 g，甚至，甚至10-11 g。5. 可用于高沸点的、不能气化的、热

2、不稳定的以及可用于高沸点的、不能气化的、热不稳定的以及具有生理活性物质的分析具有生理活性物质的分析 二、二、HPLCHPLC与与GCGC差别差别 1分析对象的区别 GC： 适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%) HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品包括有机介质溶 液，不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。占有机物 的80%2 2流动相的区别流动相的区别GCGC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲协作用：

3、流动相为惰性，气体组分与流动相无亲协作用 力，只与固定相有相互作用。力，只与固定相有相互作用。 HPLCHPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲协作用：流动相为液体，流动相与组分间有亲协作用 力，能提高柱的选择性、改善分别度，对分别起力，能提高柱的选择性、改善分别度，对分别起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和变流动相极性和pHpH值也对分别起到调控作用，当值也对分别起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分别选择性。也可以增大分别选择性。3 3操作条件

4、差别操作条件差别GCGC：加温操作：加温操作HPLCHPLC：室温；高压液体粘度大，峰展宽小：室温；高压液体粘度大，峰展宽小 可对水果、蔬菜中的农药残留量进展分析。 稠环芳烃多为致癌物质。稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器第二节第二节 影响色谱峰扩展及色谱分别的要素影响色谱峰扩展及色谱分别的要素 影响分别的主要要素有流动相的流量、

5、影响分别的主要要素有流动相的流量、性质和极性。性质和极性。 在高效液相色谱中, 速率方程中的分子分散项B/U较小，可以忽略不计，而只需两项，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的外形不同，如下图：1流速：流速大于流速：流速大于0.5 cm/s时时, Hu曲线是曲线是一段斜率不大的直线。一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不降低流速，柱效提高不是很大。但在实践操作是很大。但在实践操作中，流量仍是一个调整中，流量仍是一个调整分别度和出峰时间的重分别度和出峰时间的重要可选择参数。要可选择参数。(2) 液体的粘度比气体大一百倍液体的粘度比气体大一百倍,密度为气体的一千倍密度为

6、气体的一千倍,故降低传质阻力是故降低传质阻力是LC中提高柱效的主要途径。中提高柱效的主要途径。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不能够经过添加柱温来改善传质。恒温 改动淋洗液组成、极性是改善分别的最直接的要素。1分别原理：利用组分分子占据固定相外表吸附分别原理：利用组分分子占据固定相外表吸附 活性中心才干的差别活性中心才干的差别 分别前提：分别前提：K不等或不等或k不等不等一、液固吸附色谱法一、液固吸附色谱法LSC 流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂2 2固定相固定相分为极性和非极性两类分为极性和非极性两类极性固定相：极性固定相： 硅胶、氧化铝和

7、氧化镁、硅酸镁分子筛等，其硅胶、氧化铝和氧化镁、硅酸镁分子筛等，其 中极性硅胶运用最普遍。中极性硅胶运用最普遍。非极性固定相：非极性固定相： 多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分 子多孔微球等。子多孔微球等。1 1硅胶：硅胶： 无定型硅胶无定型硅胶 最早运用，传质慢、柱效低最早运用，传质慢、柱效低薄壳型硅胶薄壳型硅胶 直径为直径为3040m3040m的玻璃珠外表涂布一层的玻璃珠外表涂布一层12m12m 厚的硅胶微粒，孔径均一、浸透性好、传厚的硅胶微粒，孔径均一、浸透性好、传质质 快，但柱容量有限。快，但柱容量有限。全多孔球型硅胶全多孔球型硅胶 粒度普

8、通为粒度普通为510m510m，颗粒和孔径的均一性，颗粒和孔径的均一性都比都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。的主体，也是键合固定相的主要基质。原理原理- -吸附吸附 特点特点- -峰易拖尾峰易拖尾 适用适用- -分别极性化合分别极性化合物物2 2高分子多孔小球：高分子多孔小球： 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分别弱极性化合物适用：分别弱极性化合物3 3流动相流动相 除了最根本的要求之外，主要思索溶剂强除了最根本的要求之外，主要思索溶剂强度，溶解度参数及极性参数等。度

9、，溶解度参数及极性参数等。1 1分别原理：利用组分在两相中溶解度的差别分别原理：利用组分在两相中溶解度的差别2 2固定相：载体固定相：载体+ +固定液物理或机械涂渍法缺固定液物理或机械涂渍法缺 点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固 定液易流失，从而导致柱效降低，被键定液易流失，从而导致柱效降低，被键 合相填料所取代。合相填料所取代。3 3正相色谱正相色谱- -固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性NLLCNLLC 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分别极性组分。适于分别极性组分。 反相色谱反相色谱- -固定液

10、极性固定液极性 流动相极性流动相极性RLLCRLLC 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分别非极性组分。于分别非极性组分。二、液液分配色谱法二、液液分配色谱法LLC 键合相色谱根本上属于分配色谱，与液液分键合相色谱根本上属于分配色谱，与液液分配色谱固定相不同的是配色谱固定相不同的是“固定液以化学键的方固定液以化学键的方式与载体结合在一同的。式与载体结合在一同的。常规化学键合相常规化学键合相利用化学反响将固定液的官能团键合在载体外表利用化学反响将固定液的官能团键合在载体外表 1 1分别机制：分配分别机制：分配+ +吸附以吸附以LLCLLC为根底为根

11、底 2 2特点：特点： 不易流失不易流失 热稳定性好热稳定性好 化学性能好化学性能好 载样量大载样量大 适于梯度洗脱适于梯度洗脱4.4.化学键合相色谱化学键合相色谱CPCCPC三、离子色谱法三、离子色谱法IC1. 1. 离子交换色谱离子交换色谱 凡在溶液中可以电离的物质，通常都可以用离子凡在溶液中可以电离的物质，通常都可以用离子交换色谱法进展分别，其主要根据固定相对待测离子交换色谱法进展分别，其主要根据固定相对待测离子对的亲和力的差别来实现分别。对的亲和力的差别来实现分别。固定相类型：强阳离子交换剂如磺酸基固定相类型：强阳离子交换剂如磺酸基 强阴离子交换剂如季胺基强阴离子交换剂如季胺基 弱阳离

12、子交换剂如羧基弱阳离子交换剂如羧基 弱阴离子交换剂如氨基弱阴离子交换剂如氨基流动相以水相缓冲液为主，有时加少量有机改性剂。流动相以水相缓冲液为主，有时加少量有机改性剂。 离子色谱是在20世纪70年代中期开展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。2. 2. 离子色谱法离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分别方法。是由离子交换色谱法派生出来的一种分别方法。3. 3. 离子对色谱离子对色谱 离子对色谱是一种分分别子型化合物的特殊分离子对色谱是一种分分别子型化合物的特殊分离方

13、式。离方式。 采用非极性固定相分别弱酸或弱碱等可离子化采用非极性固定相分别弱酸或弱碱等可离子化的物质时，因其在固定相上的保管作用很弱，不易的物质时，因其在固定相上的保管作用很弱，不易分别。故在流动相中加一种与被分析物极性相反的分别。故在流动相中加一种与被分析物极性相反的离子离子对试剂，使其与被分析物构成缔合离子离子对试剂，使其与被分析物构成缔合物，从而添加保管，提高分别度。物，从而添加保管，提高分别度。四、排阻色谱色谱四、排阻色谱色谱size- exclusion chromatography 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分别。小分子可以分散到凝胶空隙，由其中经过，

14、出峰最慢；中等分子只能经过部分凝胶空隙，中速经过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分别 五、五、 亲和色谱亲和色谱(AC) Affinity chromatograph 原理：利用生物大分子和固定相外表存在的某种特异性亲和力，进展选择性分别。 先在载体外表键合上一种具有普通反响性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再衔接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保管。改动淋洗液后洗脱。六、分别类型选择六、分别类型选择 choice of separation

15、 types 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分别的样品时，谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分别的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进展分流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进展分别，然后依先后顺序进入别，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。此得到液相色谱图。 此外还配有自动进样及数据处置等辅助安装。此外还配有自动进样及数据处置等辅助安装。 仪器组成仪器组成高压输液系统进样系统分

16、别系统检测系统数据处置系统溶剂贮液瓶溶剂贮液瓶v用途：储存流动相溶剂用途：储存流动相溶剂v资料：玻璃或塑料，无色或棕色，资料：玻璃或塑料，无色或棕色，v容积：约为容积：约为0.52.0Lv位置：高于泵，以保一定的输液静压差。位置：高于泵，以保一定的输液静压差。 1.高压输液系统高压输液系统 高压输液泵高压输液泵v是是HPLC系统中最重要的部件之一。系统中最重要的部件之一。v输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。量和分析结果的可靠性。输液泵应具备的性能输液泵应具备的性能流量稳定。对定性定量的准确性至关重要。流量稳定。对定性定量的准确性至

17、关重要。流量范围宽，分析型应在流量范围宽，分析型应在0.110 ml/min范围内延续可调，范围内延续可调，制备型能到达制备型能到达100ml/min。输出压力高，普通可高达输出压力高，普通可高达400500 kg/cm2。液缸容积小，适于梯度洗脱。液缸容积小，适于梯度洗脱。密封性好，耐腐蚀。密封性好，耐腐蚀。输液泵类型输液泵类型1 螺旋注射泵螺旋注射泵2 往复柱塞泵往复柱塞泵3 往复隔膜泵往复隔膜泵4 气动放大泵气动放大泵目前运用最多的是柱塞往复泵。目前运用最多的是柱塞往复泵。泵的运用与维护泵的运用与维护v 防止任何固体微粒进入泵体，因此应过滤流动相。防止任何固体微粒进入泵体，因此应过滤流动

18、相。v 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应停泵过夜或保管在泵内更长时间。必需泵入纯水将泵充应停泵过夜或保管在泵内更长时间。必需泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适宜于保管色谱柱和有利于泵维护的溶分清洗后，再换成适宜于保管色谱柱和有利于泵维护的溶剂。剂。v 防止流动相耗尽空泵运转，导致柱塞磨损、缸体或密封损防止流动相耗尽空泵运转，导致柱塞磨损、缸体或密封损v 坏，最终产生漏液。坏，最终产生漏液。v 输液泵的任务压力不能超越规定的最高压力，否那么会使高输液泵的任务压力不能超越规定的最高压力，否那么会使高压密封环变形，产生漏液压密封环变

19、形，产生漏液(40 MPa, 400 bar, 5800 psi)。v 流动相应脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，流动相应脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，假设有大量气泡，泵就无法正常任务。假设有大量气泡，泵就无法正常任务。单流路真空脱气安装的原理单流路真空脱气安装的原理高压梯度安装构造四元低压梯度系统构造合。合。4.进样系统进样系统v 作用：将试样引入色谱柱作用：将试样引入色谱柱v 位置：在高压泵和色谱柱之间位置：在高压泵和色谱柱之间v 类型：手动或自动类型：手动或自动v 进样器：六通阀进样器：六通阀 进样器进样器 手动手动 经注射器进样经注射器进样自动自动 六通阀六通阀

20、 圆盘式自动进样器圆盘式自动进样器 链式自动进样器链式自动进样器六通阀手动进样器原理表示图六通阀手动进样器原理表示图 Load Inject 手动进样器手动进样器v 用微量注射器将样品溶液注入六通阀用微量注射器将样品溶液注入六通阀v 留意必需运用留意必需运用HPLC公用平头微量注射器，不能运用气公用平头微量注射器，不能运用气相色谱尖头微量注射器，否那么会损坏六通阀。相色谱尖头微量注射器，否那么会损坏六通阀。v 进样方式：有部分装液法和完全装液法进样方式：有部分装液法和完全装液法自动进样器自动进样器v 由计算机自动控制进样六通阀、计量泵和进样针的位由计算机自动控制进样六通阀、计量泵和进样针的位置

21、，按预先编制的进样操作程序任务，自动完成定量置，按预先编制的进样操作程序任务，自动完成定量取样、洗针、进样、复位等过程。取样、洗针、进样、复位等过程。 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。 柱管资料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合资料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。 普通色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。 普通在分别前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分别柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分别柱时不再洗脱其中固定相，保证分别柱的性能不受影响。 柱子装填得好坏

22、对柱效影响很大。对于细粒度的填料柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料20m普通采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，普通采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。经冲洗后，即可备用。 普通柱体为直型不锈钢管，内径普通柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。开展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。开展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。柱温箱柱温箱v 用于使色谱柱恒温的安装，普通其控温范围高于室温，也用于使色谱柱恒温的安装，普通其控温范围高于室

23、温，也可低于室温，通常控制柱温在可低于室温，通常控制柱温在3040。有些柱温箱还。有些柱温箱还具有柱切换安装。具有柱切换安装。v 色谱柱的任务温度对保管时间、相对保管时间、溶剂的溶色谱柱的任务温度对保管时间、相对保管时间、溶剂的溶解才干、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。普通升解才干、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。普通升高柱温，可添加组分在流动相中的溶解度，减小分配系数高柱温，可添加组分在流动相中的溶解度，减小分配系数K，缩短分析时间；还可降低流动相的黏度，降低柱压与，缩短分析时间；还可降低流动相的黏度，降低柱压与提高柱效。提高柱效。 1 1紫外紫外- -可见吸收检测器可见吸收检测器U

24、V-VisUV-Vis： 适用于吸收紫外或可见光的物质适用于吸收紫外或可见光的物质 灵敏度较高，运用范围较广灵敏度较高，运用范围较广 ( (光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器DAD)DAD) 2 2荧光检测器荧光检测器FLDFLD： 只能分析具有荧光活性的物质只能分析具有荧光活性的物质 灵敏度高，但适用范围有限灵敏度高，但适用范围有限 3 3示差折光检测器示差折光检测器RIDRID： 利用折光率的差别来检测，为通用型利用折光率的差别来检测，为通用型 检测器，但灵敏度低，温度要求严厉检测器，但灵敏度低，温度要求严厉 4 4电化学检测器：电化学检测器： 常用的有电导检测器和安培检测器常用的有

25、电导检测器和安培检测器 电导检测器是丈量物质在流动相中电离后所引起电导检测器是丈量物质在流动相中电离后所引起的电导率的变化，组分浓度越高，电离产生的离的电导率的变化，组分浓度越高，电离产生的离子浓度越高，电导率变化就越大，多用于离子色子浓度越高，电导率变化就越大，多用于离子色谱。谱。 安培检测器适用于测定一切在任务电极的电压范安培检测器适用于测定一切在任务电极的电压范围内发生氧化或复原反响的物质，在生化样品分围内发生氧化或复原反响的物质，在生化样品分析中运用广泛，是迄今最灵敏的析中运用广泛，是迄今最灵敏的HPLCHPLC检测器。检测器。5 5其他检测器其他检测器 化学发光检测器、质谱检测器等化

26、学发光检测器、质谱检测器等HPLC分析根本操作分析根本操作v 1预备：流动相配制、脱气，样品制备。预备：流动相配制、脱气，样品制备。v 2开机：依次翻开计算机、泵、检测器、柱温箱电源开开机：依次翻开计算机、泵、检测器、柱温箱电源开关，仪器自检。关，仪器自检。v 3装柱：将吸液头插入曾经过滤和脱气处置的甲醇中，装柱：将吸液头插入曾经过滤和脱气处置的甲醇中，开启泵，使液体流出，调流速在开启泵，使液体流出，调流速在0.2mL/min，衔接色谱柱，衔接色谱柱留意方向，待液体流出色谱柱后，再与检测器衔接。留意方向，待液体流出色谱柱后，再与检测器衔接。v 4平衡：升高流速常规分析柱普通至平衡：升高流速常规分析柱普通至1 mL/min，大约大约15min后，换上预备的流动相假设流动相含盐或后，换上预备的流动相假设流动相含盐或甲醇比例较低，中间需适当过渡，待基线走稳。甲醇比例较低，中间需适当过渡，待基线走稳。v 5仪器面板或色谱任务站设置分析条件，如设置泵参仪器面板或色谱任务站设置分析条件，如设置泵参数：任务