植物组织MDA含量测定

1、植物组织MDA含虽测定、目的要求1 .掌握植物组织 MDA 含量测定的原理及具体测量步骤；2.深化理解 MDA 与逆境和衰老的关系，理解植物组织 MDA 含量测定的意义;3.了解膜脂过氧化、氧自由基和 MDA 形成的关系；4 .能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定 MDA 含量；5.学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。二、实验原理植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋 白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失 调等。活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，从而引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会

2、导致植物细胞死亡。膜脂过氧化的产物有二烯钥合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙 二醛(Malondialdehyde, MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还 能加剧膜的损伤。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA 含量是一个常用指标，可通过测定 MDA 了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度 以及植物的抗逆性。MDA 在高温及酸性环境下可与 2-硫代巴比妥酸(TBA)反应，产生红棕色 的产物3,5,5-三甲基恶坐 2,4-二酮(Trimetnine)，乂名三甲川，该物质在 532nm 处有最大光吸收，在 600nm 处有最小光吸收。由丁 TBA也可与其它物质反应，

3、 并在 532nm 处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定 600nm 下的吸光度，利用 532nm 与 600nm下的吸光度的差值计算 MDA 的浓度。即：A532 A600= C L式中，A532和 A600分别表示 532nm和 600nm处的吸光度值，C 是 MDA 浓度,需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对 MDA-TBA 反应有干扰作用。可L 为比色杯厚度， =155L - mri1oim-1o用下列公式消除由蔗糖引起的误差C (Hmol：1)=6.45”532 A600) 0.56 A450三、材料与设备1.材料：四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室

4、温对照。2.仪器：(1)分光光度计；(2)冷冻离心机；(3)水浴锅；(4)天平；(5)研钵；(6)剪刀；(7) 5ml 刻度离心管;(9)刻度试管(10ml); (10)镶子；(11)移液管(5ml、2ml、 1ml); (12)冰箱。3.药品0.05mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液；5%三氯乙酸溶液：称取 5g三氯乙酸，先 用少量蒸僻水溶解，然后定容到 100ml; (3) 0.5%的 TBA溶液：称取 0.5g硫代 巴比妥酸，用 5%三氯乙酸溶解，定容至 100ml。四、实验步骤1.MDA 的提取：取样品 0.5g (W)，加入 2ml 预冷的 0.05mol/L pH7.8 的 磷酸

5、缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转移到 5ml 刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净， 活洗液也移入离心管中，最后用缓冲液定容至 5ml。4500rpm, 4 度，离心 10min, 上活液即为 MDA提取液，测量提取液的体积(V)。2.MDA 含量测定：吸 2ml (V2)的提取液丁刻度试管中(空白为 2ml 缓 冲液)，加入 3ml 0.5%的 TBA溶液，将试管放入沸水浴中煮沸 10 min (自试管 内溶液中出现小气泡开始计时)。到时间后，立即将试管取出并放入冰浴中。 4500rpm, 4度，离心 10min,取上活液并量其体积(V1)。上活液丁 532nm、 600nm 波长下测定吸光度。3 .

6、结果计算：MDA(nmol g-1)=6.452 (A532-A600) V2 W式中，VI为反应液总量(ml); V2为反应液中的提取液数量(ml); V为提取 液总量(ml);W为植物样品重量(g)。五、实验报告样品处理重复A532A600-一-1、MDA 含重（nmol g ）高温处理1二23平均标准差绿叶室温对照123平均标准差黄叶高温处理123平均标准差室温对照123平均标准差六、思考题1.TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？2.提取液与 TBA的混合液为什么要加热？为什么加热时间乂不能过长？3 .为什么要测定反应液在 600nm 下的吸光度？4.如果可溶性糖含量影响 MDA 含量的测定，你有什么办法消除其影响？5.正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。七、注意事项1.可溶性糖与 TBA显色反应的产物在 532 nm 也有吸收（最大吸收在 450 nm）, 当植物处丁干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶