MerTK表达和ERK激活对心肌梗死后产生骨桥蛋白的修复性巨噬细胞的功能成熟至关重要

1、MerTK表达和ERK激活对心肌梗死后产生骨桥蛋白的修复性巨噬细胞的功能成熟至关重要导读背景：骨桥蛋白在心肌梗死（MI）组织修复过程中对于加速修复性纤维化以及清除死细胞发挥重要作用，并且半乳糖凝集素-3hiCD206+巨噬细胞是MI后骨桥蛋白的主要来源。白细胞介素-10 - STAT3半乳糖凝集素3轴线对MI后心肌巨噬细胞Spp1(编码骨桥蛋白)的转录激活至关重要。这里研究者探究了产生骨桥蛋白的巨噬细胞功能成熟更详细的机制。方法和结果：在MI后的心脏中，Spp1的转录活化几乎特异的发生在MerTK+半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞中。MerTK在半乳糖凝集素-3 hi巨噬细胞中的产生对于

2、功能成熟至关重要，包括胞葬作用和Spp1转录活性。MerTK+半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞能够显著活化STAT3和ERK。抑制STAT3能够抑制产生骨桥蛋白的MerTK+半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞的分化，然而，STAT3的活化并不足以诱导Spp1的转录活性。抑制ERK能够在不影响MerTK或者半乳糖凝集素-3表达的情况下抑制Spp1的转录活性。同时活化ERK是Spp1转录活化所必需的。在Il-10敲除增强的绿色荧光蛋白Spp1敲入的小鼠MI后，产生骨桥蛋白的巨噬细胞减少但是并不完全消失。白细胞介素-10和巨噬细胞克隆刺激因子协同激活STAT3和ERK，并且促进骨髓衍生巨噬细胞中产生骨桥蛋白M

3、erTK+半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞的分化。在MI的心脏中同时利用抗白介素-10以及抗巨噬细胞克隆刺激因子的抗体能够大幅度降低产生骨桥蛋白的巨噬细胞的数量。结论：白介素-10和巨噬细胞克隆刺激因子能够协同活化心肌巨噬细胞中的STAT3和ERK，反之上调半乳糖凝集素-3和MerTK，导致产生骨桥蛋白巨噬细胞的功能成熟。实验设计结果1  MI后MerTK在心肌骨桥蛋白产生的巨噬细胞中表达 研究者分析了EGFP-Spp1敲入的报告小鼠在假手术或者MI后三天的心脏。尽管在两者的心脏中都发现了巨噬细胞，但是每个组中的细胞具有不同的特性。典型的是，产生骨桥蛋白半乳糖凝集素-

4、3hi的巨噬细胞在MI后的心脏中出现。在假手术组的心脏中，心肌F4/80+ CD11b+Ly6G巨噬细胞表达MerTK（图1A）。这一结果与其他的报道一致，并且说明MerTK+巨噬细胞在维持组织内稳态中发挥重要作用。在MI后的心脏中MerTK+巨噬细胞的绝对数量增加（图1A-1C）。MerTK在半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞中表达（图1D）。绿色荧光蛋白表达的巨噬细胞共表达MerTK和半乳糖凝集素-3（图1E）。因此，共表达MerTK和半乳糖凝集素-3的心肌巨噬细胞能够在MI后产生骨桥蛋白。 图1. 半乳糖凝集素-3hi MerTK+巨噬细胞是MI后骨桥蛋

5、白的重要来源。（A-C）流式细胞分析假手术和MI后三天F4/80+ CD11b+ Ly6G巨噬细胞的表达；图A散点图说明F4/80+ CD11b+Ly6G巨噬细胞内半乳糖凝集素-3和MerTK表达；B图条形图说明F4/80+ CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3 hi MerTK+细胞的比例；C图条形图说明每mg半乳糖凝集素-3 hi MerTK+  F4/80+ CD11b+Ly6G的细胞数量；（D-E）流式分析MI后半乳糖凝集素-3 hi MerTK+和半乳糖凝集素

6、-3 hi MerTK-表达F4/80+ CD11b+Ly6G细胞中EGFP-Spp1的表达。图D散点图表示MI后三天F4/80+ CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3和MerTK表达；图E直方图代表MI后三天半乳糖凝集素-3 hi MerTK+和半乳糖凝集素-3 hi MerTK-表达F4/80+ CD11b+Ly6G细胞中Spp1-GFP表达的细胞；流式细胞分析至少进行了3次独立实验，数据是均值±SEM，*P<0.001，EGFP表示增强型绿色荧光蛋白，GFP表示绿色荧光蛋白，M

7、erTK是Mer酪氨酸激酶，MI表示心肌梗死。 2 MerTK的表达是产生骨桥蛋白巨噬细胞功能成熟所必需的 巨噬细胞中，CD206+ (M2)亚型被划分为修复型巨噬细胞。白介素-10和白介素-4诱导M2样巨噬细胞的分化以及半乳糖凝集素-3的表达，但是只有白介素-10能够诱导Spp1的转录活化。在BM源性的CD11b+Ly6G细胞的培养中，rIL-10能够诱导MerTK和半乳糖凝集素-3的表达，而rIL-4只能诱导半乳糖凝集素-3的表达（图2A和2B）。当用rIL-10刺激EGFP-Spp1-敲入报告小鼠的BM源性CD11b+Ly6G细胞时，研究者发现在MerTK阳性的细胞中

8、Spp1转录活化（图2C）。然而研究者并未在MerTK阴性的细胞中观察到Spp1的转录活化（图2D）。因此MeTK的表达是产生骨桥蛋白巨噬细胞功能成熟所必需的。 图2. 体外白介素-10处理后骨髓源性CD11b+Ly6G细胞分化为产生骨桥蛋白的细胞，能够同时表达半乳糖凝集素-3hi以及MerTK。（A-D）CD11b+Ly6G细胞取自8-到10-周EGFP-Spp1敲入报告小鼠的骨髓，并且利用rIL-4或者rIL-10共培养3天。A和B图采用流式分析检测了细胞内半乳糖凝集素-3和MerTK表达（每组中n=5）；图A散点图说明rIL-4或者rIL-10处理的CD11b+Ly6

9、G细胞内半乳糖凝集素-3和MerTK表达；图B条形图说明CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3 hiMerTK+细胞的表达；图C散点图说明rIL-10处理MerTK+CD11b+Ly6G细胞中Spp1-GFP的表达；图D直方图表示半乳糖凝集素-3hiMerTK+和半乳糖凝集素-3hiMerTK表达的CD11b+Ly6G细胞中Spp1-GFP的表达；流式细胞分析至少进行了3次独立实验，数据是均值±SEM，*P<0. 01，EGFP表示增强型绿色荧光蛋白，GFP表示绿色荧光蛋白，MerTK是Mer酪氨酸激酶，MI表示心肌梗死，rIL表示重组白介素。 3 ST

10、AT3信号通路诱导MerTK 研究者在之前的报道中证实Spp1的转录活化需要STAT3信号通路的活化。为了证实STAT3的活化参与MerTK的表达，研究者在Stattic（STAT3抑制剂）存在或不存在的条件下，利用rIL-10 刺激EGFP-Spp1敲入报告小鼠的BM源性CD11b+Ly6G细胞。在Stattic存在时，没有BM源性的CD11b+Ly6G细胞分化为MerTK+半乳糖凝集素-3hi的亚型（图3A和3B）。在rIL-10刺激后，Lgals3敲除小鼠中的CD11b+Ly6G细胞分化为MerTK表达细胞的速率与WT小鼠相同（图3C）。 接下来，在EGFP-Spp1

11、敲入报告小鼠中rIL-10刺激用BM源性CD11b+Ly6G细胞中，将MerTK通过小干扰RNA显著敲低（图3D）。MerTK小干扰RNA敲除后并不影响STAT3的活化（图3E），但是却降低了半乳糖凝集素3hiCD206+巨噬细胞的分化能力（图3F和3G），并且显著抑制CD206+巨噬细胞中Spp1的转录活性（图3H和3I）。研究者在Spp1 WT 和敲除小鼠的BM源性CD11b+Ly6G细胞中观察到在rIL-10刺激后MerTK+半乳糖凝集素3hi亚群的分化能力相似（图3J）。 MerTK能够特异性的调节炎症环境中凋亡细胞的吞噬作用，并且这一生物学过程需要MerTK的活化。然而将过

12、氧化物处理的凋亡心肌细胞与CD11b+Ly6G细胞共培养，并未诱导Spp1的转录活性。此外，MerTK的配体Gas6是一种维生素K依赖的蛋白，在MerTK活化的下游信号通路中发挥重要作用。Spp1-EGFP敲入的小鼠MI后利用维生素K抑制剂warfarin处理，在0-3天能够抑制Gas6的功能。然而两组Spp1的转录活性相似。因此，MerTK通过STAT3信号通路活化上调，并且MerTK的表达能够活化半乳糖凝集素-3 hi巨噬细胞的分化以及Spp1的转录。 图3. STAT3-MerTK-Galectin-3轴线调节体外骨桥蛋白的表达。（A-B）CD11b+Ly6

13、G细胞取自8-到10-周WT小鼠的骨髓并且利用rIL-10+DMSO或者rIL-10+Stattic培养3天，图A散点图表示CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3 hiMerTK+的表达；图B条形图表示CD11b+Ly6G细胞半乳糖凝集素-3 hiMerTK+的表达（每组n=5）；（C）CD11b+Ly6G细胞取自8-到10-周WT或者Lgals3 KO小鼠的骨髓并且利用rIL-10培养3天，条形图说明经过流式分析CD11b+Ly6G细胞MerTK的表达（每组n=5）；（D-I）CD11b+Ly6G细胞取自8-到10-周EGFP-Spp1敲入报告小鼠的骨髓，并且在rIL

14、-10培养3天的同时进行siControl或者siMerTK，条形图说明CD11b+Ly6G细胞中MerTK（图D）和pSTAT3（图E）的表达；F图散点图代CD206+ CD11b+ Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3；G图条形图说明CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3 hiCD206+的表达；H图散点图表示CD206+ CD11b+Ly6G细胞中的Spp1-GFP；I图条形图说明CD11b+Ly6G细胞中Spp1-GFP的表达（每组n=5）；CD11b+Ly6G细胞取自8-到10-周WT或者Spp1敲除小鼠，并且利用rIL-10培养3天，图J条形图

15、说明CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3hiMerTK+的表达（每组n=3）。流式细胞分析至少进行了3次独立实验，数据是均值±SEM，*P<0. 01，n.s.表示没有显著性差异，EGFP表示增强型绿色荧光蛋白，GFP表示绿色荧光蛋白，MerTK是Mer酪氨酸激酶，MI表示心肌梗死，rIL表示重组白介素，STAT3表示信号转导和转录激活因子3，WT表示野生型。4  MI后心肌巨噬细胞中MerTK的表达需要STAT3的活化 研究者之前报道称相较于WT小鼠，在Il-10敲除的MI心脏心肌巨噬细胞中STAT3酪氨酸磷酸化的水平更低且半乳糖凝集素3h

16、iCD206+亚群更少。在本研究中，研究者发现在Il-10 KO小鼠中MerTK+半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞的比例和绝对数量显著少于WT小鼠（图4A-4C）。 研究者之前报道Stattic处理能够抑制MI后产生骨桥蛋白半乳糖凝集素-3hiCD206+巨噬细胞的出现。在这里Stattic抑制MI三天后心肌巨噬细胞中STAT3的磷酸化，并且显著降低MI后心脏中MerTK+半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞的比例和绝对数量（图4D-4F）。相反，MI后心脏中MerTK+巨噬细胞的比例和绝对数量在Lgals3敲除的小鼠和WT小鼠中相似（图4G-4H）。在Spp1敲除的小鼠和WT小鼠中MerTK+

17、半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞的比例相似（图4I-4J）。因此，MI后依赖心肌巨噬细胞中STAT3活化诱导MerTK的表达不依赖于半乳糖凝集素-3或者骨桥蛋白的表达。 图4. 抑制STAT3酪氨酸的磷酸化能够抑制MI后心肌细胞中MerTK 的表达。（A-C）流式分析检测WT和Il-10敲除小鼠MI三天后，F4/80+CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3以及MerTK的表达；图A散点图表示F4/80+CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3 hiMerTK+的表达；图B和图C条形图分别说明F4/80+CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3 hiM

18、erTK+细胞的比例和细胞数量（每组n=5）；（D-F）从MI前1天到MI后3天对WT小鼠腹腔注射DMSO或者Stattic，图D说明F4/80+CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3hiMerTK+细胞的散点图，图E条形图说明CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3hiMerTK+细胞的比例，图F说明每毫克半乳糖凝集素-3 hiMerTK+F4/80+CD11b+Ly6G细胞的细胞数量（每组n=8）；（G-H）流式分析WT或者Lgals3敲除小鼠MI后，F4/80+CD11b+Ly6G细胞中MerTK的水平，图G条形图说明F4/80+CD11b+Ly6G细胞中MerTK+细胞

19、的比例以及每毫克细胞数量（n=4）；（I-J）流式分析WT或者Spp1敲除小鼠F4/80+CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3 hiMerTK+的表达；图I散点图代表F4/80+CD11b+Ly6G细胞中乳糖凝集素-3 hiMerTK+的表达；图J条形图说明F4/80+CD11b+Ly6G细胞中MerTK+细胞的比例。流式细胞分析至少进行了3次独立实验，数据是均值±SEM，*P<0.05, *P<0.001，n.s.表示没有显著性差异，EGFP表示增强型绿色荧光蛋白，GFP表示绿色荧光蛋白，MerTK是Mer酪氨酸激酶，MI表示心肌梗死，pSTA

20、T3表示磷酸化的信号转导和转录激活因子3，WT表示野生型，rIL表示重组白介素。 5 巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)参与MI后产生OPN巨噬细胞的分化 当Il-10敲除EGFP-Spp1敲入的报告小鼠产生MI时，在心肌巨噬细胞中绿色荧光蛋白阳性细胞的比例显著降低，但是并没有完全消失（图5A和5B），表明除了白介素-10存在其他细胞因子能够促进产生骨桥蛋白的巨噬细胞分化。已知M-CSF在活化巨噬细胞的分化中发挥重要作用，并且白介素-10和M-CSF的共刺激调节MerTK的表达。 为了探究M-CSF在MI后产生骨桥蛋白巨噬细胞分化中的作用，研究者利用对照IgG、a

21、nti-白介素-10的抗体、anti-白介素10的抗体以及anti-MCSF的抗体处理EGFP-Spp1敲入的MI小鼠。在心肌巨噬细胞中STAT3磷酸化（图5C）、MerTK+半乳糖凝集素-3hi细胞的绝对数量（图5D-5F）以及绿色荧光蛋白阳性细胞的比例和绝对数量受抗-白介素-10抗体的抑制，在联合应用抗-白介素10以及抗MCSF抗体时大幅度抑制。研究者在体外将EGFP-Spp1敲入小鼠BM源性CD11b+Ly6G细胞利用rIL-10或者rIL-10与rMCSF联合刺激。结果发现rIL-10和rM-CSF的联合刺激能够诱导更多MerTK+半乳糖凝集素-3hi细胞以及绿色荧光蛋白阳性细胞的活化

22、。同样，rIL-10与rM-CSF联合刺激能够显著活化胞葬作用。因此白介素-10和M-CSF能够协同促进产生骨桥蛋白MerTK+半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞的分化，导致MI心脏中死亡细胞的有效清除。 图5. 白介素-10需要M-CSF诱导体内产生骨桥蛋白巨噬细胞的分化并且上调半乳糖凝集素-3以及MerTK。（A-B）流式分析Il-10 WT 或者Il-10 KO EGFP-Spp1-敲入报告小鼠MI后三天CD11b+Ly6G细胞中GFP的表达，如图A散点图所示。图B条形图说明 CD11b+Ly6G细胞中GFP+表达的比例；（C-I）在EGFP-Spp1-敲入报告小

23、鼠的腹腔注射IgG、白介素-10以及白介素-10+M-CSF抗体。直方图代表心肌CD11b+Ly6G细胞中pSTAT3 (Y705)的表达；图C流式分析不同抗体处理F4/80+CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3以及MerTK的表达；图说明F4/80+CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3 hiMerTK的表达；图E条形图说明F4/80+CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3 hiMerTK+F4/80+CD11b+Ly6G细胞的数量；图F说明每毫克半乳糖凝集素-3 hiMerTK中的细胞数量；图G表示F4/80+CD11b+Ly6G中Spp1-GF

24、P的表达；图H条形图说明F4/80+CD11b+Ly6G细胞中Spp1-GFP表达的比例；图I条形图说明每毫克GFP+F4/80+CD11b+Ly6G细胞中的细胞数量；流式细胞分析至少进行了3次独立实验，数据是均值±SEM，*P<0.05, *P<0.01, *P<0.001，EGFP表示增强型绿色荧光蛋白，GFP表示绿色荧光蛋白，M-CSF 表示巨噬细胞克隆刺激因子，MerTK是Mer酪氨酸激酶，MI表示心肌梗死，pSTAT3表示磷酸化的信号转导和转录激活因子3，rIL表示重组白介素。 6 Spp1的转录活化需要ERK1/2的活化 研究者之前报

25、道称白介素-10-STAT3-半乳糖凝集素-3轴线对于产生骨桥蛋白修复型巨噬细胞的极化非常关键。Colivelin是一种能够活化STAT3神经保护肽。在EGFP-Spp1敲入小鼠BM源性CD11b+ Ly6G细胞培养中利用Colivelin刺激后，能够显著诱导STAT3的活化以及半乳糖凝集素-3的上调。然而colivelin并不能诱导这些细胞中Spp1的转录活性。 除了STAT3的活化，ERK1/2的活化对于活化巨噬细胞的分化非常关键。在EGFPSpp1敲入小鼠BM源性CD11b+ Ly6G细胞培养中rIL-10能够激活ERK1/2，但是rIL-4并不能活化ERK

26、1/2。rIL-10和rM-CSF共刺激能够显著活化ERK1/2（图6A），ERK1/2的抑制剂SCH772984能够显著抑制rIL-10和rM-CSF诱导的ERK1/2活化（图6B）；Spp1的转录活性也受SCH772984抑制（图6C）。SCH772984并不影响STAT3的活化或者半乳糖凝集素-3hi MerTK+亚群的分化（图6E）。然而rIL-10和rM-CSF共刺激导致的ERK活化并不受Stattic对STAT3活性的抑制或者Lgals3或者MerTK敲除的影响。当用rIL-10和rM-CSF共刺激时，Spp1敲除小鼠源性CD11b+ Ly6G细胞ERK1/2活

27、化的水平与WT小鼠源性CD11b+ Ly6G细胞中相似。 图6. ERK1/2的磷酸化调节体外OPN的表达。（A）CD11b+Ly6G细胞取自8-10周WT小鼠骨髓并且在rIL-10 或者rIL-10+rM-CSF条件下培养3天；图A条形图说明CD11b+Ly6G细胞中pERK1/2 (Thr202/Tyr204)的表达；(B-E) CD11b+Ly6G细胞取自8-10周WT小鼠的骨髓并且在rIL-10+rM-CSF+DMSO、rIL-10+rM-CSF+SCH772984 (ERK1/2抑制剂)、或者DMSO条件下培养3天；图B条形图说明CD11b+L

28、y6G细胞中pERK1/2 (Thr202/Tyr204)的表达；图C散点图表示EGFP-Spp1的表达；图D条形图说明EGFP-Spp1的比例；图E条形图说明CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3hi MerTK+表达的比例。流式细胞分析至少进行了3次独立实验，数据是均值±SEM， *P<0.001，n.s.表示没有显著性差异，EGFP表示增强型绿色荧光蛋白，GFP表示绿色荧光蛋白，ERK表示细胞外信号调节激酶，M-CSF 表示巨噬细胞克隆刺激因子，MerTK是Mer酪氨酸激酶，MI表示心肌梗死，pERK表示磷酸化细胞外信号调节激酶，rIL表示重组白介素。

29、60;MI后心肌巨噬细胞中ERK1/2体内活化发生在第三天，在假手术中并未发现（图7A和7B）。研究者在MerTK+半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞中观察到ERK1/2的活化。在EGFP-Spp1敲入报告小鼠中诱导MI后，向腹腔注射SCH772984能够在心肌巨噬细胞中抑制ERK1/2的活化（图7C和7D）。ERK1/2的抑制并不影响STAT3的磷酸化或者MerTK+半乳糖凝集素-3hi在所有心肌巨噬细胞中的比例（图7E和7F），但是SCH772984对ERK1/2的抑制能够显著抑制Spp1的转录活性（图7G-7I）。另一方面，Stattic的处理并不影响MI后心肌巨噬细胞中ERK1/2的活化。将

30、白介素-10和M-CSF中和抗体共处理能够抑制MI后心肌巨噬细胞中ERK1/2的活化。在Spp1敲除小鼠或者WT小鼠心肌巨噬细胞中ERK1/2磷酸化并没有差异。因此白介素-10和M-CSF能够不依赖于STAT3协同活化ERK1/2，这种不依赖于STAT3的ERK1/2活化信号通路对于MI后MerTK+半乳糖凝集素-3hi巨噬细胞的转录激活是非常重要的。 图7. ERK1/2磷酸化调节体内骨桥蛋白的表达。（A）直方图说明假手术或者MI后三天F4/80+ CD11b+Ly6G细胞中pERK1/2 (Thr202/Tyr204)的表达；（B）条形图说明F4/80+CD1

31、1b+Ly6G细胞中pERK1/2(Thr202/Tyr204)表达的比例；（C-I） MI前1天到MI后三天，EGFP-Spp1敲入报告小鼠腹腔注射DMSO或者SCH772984 (ERK1/2抑制剂)，图C流式直方图表示DMSO或者SCH772984处理F4/80+CD11b+Ly6G细胞中pERK1/2的表达；图D条形图表示F4/80+CD11b+Ly6G细胞中pERK1/2 (Thr202/Tyr204)表达细胞的比例；流式分析MI后DMSO或者SCH772984处理F480+CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3和MerTK的表达，图E散点图表示F4/80+CD11b+Ly6G细

32、胞中半乳糖凝集素-3hi MerTK的表达；图F条形图说明CD11b+Ly6G细胞中半乳糖凝集素-3hi MerTK的比例；图G散点图说明F4/80+CD11b+Ly6G细胞中GFP-MerTK+的表达；图H条形图说明F4/80+CD11b+Ly6G细胞中Spp1-GFP+的比例；图I条形图表示每毫克Spp1-GFP+F4/80+CD11b+Ly6G细胞的数量。流式细胞分析至少进行了3次独立实验，数据是均值±SEM，*P<0.01, *P<0.001，n.s.表示没有显著性差异，EGFP表示增强型绿色荧光蛋白，ERK表示细胞外信号调节激酶，MerTK是Mer酪氨酸激酶，MI表示心肌梗死，pERK表示磷酸化细胞外信号调节激酶。 7 重组M-CSF能够通过产生OPN巨噬细胞的分化加速梗死修复 为了检测rM-CSF治疗能否通过诱导产生骨桥蛋白巨噬细胞的分化加速梗死修复，研究者利用rM-CSF或者对照处理了MI后EGFPSpp1敲入报告小鼠0-3天。rM-CSF提高了MI后F4/80+C