寄生虫病实验三

1、实验三 弓形虫病的免疫学诊断一、内容1. 弓形虫病病原学诊断2. 弓形虫病的间接红细胞凝集试验3. 弓形虫的 ELISA 免疫诊断二、参考资料1. 弓形虫病病原学诊断弓形虫的涂片制作及染色，取阳性小白鼠腹水一滴，于洁净的载玻片上，制成涂片，自 然干燥，甲醇固定 5 分钟，姬姆萨染色，最后“慢染” ，其方法是：将固定好的血片置于染 色缸内，加上 1:20-50 倍稀释的染色液，染色 2-12小时 ,染色时宜保持一定的温度。滋养体（速殖子）呈弓形或新月形，一端较尖，一端钝圆，大小为4 7X 2 4卩m核在中央，偏于虫体钝圆一端。染色后观察，胞浆呈浅蓝色，有颗粒，核呈深蓝紫色。在急性 病例的腹水中，

2、 常见到此种游离的单个虫体。 在宿主细胞的胞浆里， 可见有滋养体簇集在一 个囊内， 为之假包囊。 慢性病例的脑、 眼、骨骼肌中可见有包囊， 呈卵圆形， 有较厚的囊膜， 囊中有虫体（慢殖子）数十个至数千个，包囊直径50 60卩m。2. 弓形虫病的间接红细胞凝集试验诊断液保存于4C冰箱内，不应冻结。试验在96孔（12X 8） “V”型底微量血凝反应板上进行，被检血清为一排，阳性和阴性 对照血清各一排，每排最后一孔为空白对照，事先每孔顺序加入稀释液1 滴（ 0.05ml ）。然后分别用移液管吸取血清 1 滴（ 0.05ml ）于每排第一孔，按倍比进行稀释后改用 0.025ml 滴管，每孔加入1 %致

3、敏红细胞液0.025ml，振摇混合2 3分钟，加盖平放在室温（25C左 右）中 2 3 小时后观察结果。凝集价 1：64 以上为阳性， 1：32 为可疑， 1：16 以下为阴性。3酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种免疫标记技术。其原理是根据酶具有强大的催化作 用和抗原抗体反应的高度特异性特点， 在不破坏酶活性和抗原抗体免疫学特性前提下， 通过 化学交联或免疫学方法， 将酶分子联结到抗原或抗体分子上， 然后与特异性抗原或抗体反应， 形成酶标记免疫复合物。 结合在免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时， 催化其水解， 生成 肉眼可见的颜色变化，从而用比色法判断结果。用于标记的酶应具有

4、如下一些特点：有高度的特异活性和敏感性；在室温下稳定； 易于获得并能商品生产； 与底物反应后的产物易于显现。 到目前为止， 应用较多的有辣 根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、 酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和B半乳糖苷酶等，其中以辣根过 氧化物酶应用最广。辣根过氧化物酶（HRP,是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖18% ,由多个同功酶组成，分子量约40000，等电点为pH3.9 ,催化的最适pH因供氢体不同而稍有差异，一般多在 pH5左右。溶于水和50%包和度以下硫酸铵溶液。HRP的作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，使产生一定颜色的产物。过氧化物酶 的供氢体很多， 一类为可溶性产物供氢

5、体：产生的有色的可溶性产物， 可用比色法测定，如 ELISA方法中的显色剂。常用的邻苯二胺（O-phenylenylendiamine ）简称OPD橙色，最大吸收值为490nm可用肉眼判别。另一类为不溶性产物供氢体：最常用的是3, 3'二氨基联 苯胺（3, 3' -diaminobenzidine ）,简称DAB反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶 性棕色吩嗪衍生物。适用于各种免疫组化法，还用于蛋白的免疫转印试验。磷性磷酸酶， 系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取， 由多个同功酶组成。 它们的底物种类 很多，常用对硝基苯磷酸盐， 价廉无毒性。 酶解产物呈黄色， 可溶性， 最大吸收波

6、长在 400nm 处。葡萄糖氧化酶， 系从曲霉提取， 对底物葡萄糖的作用常借过氧化物酶及其显色底物来加 以显现。（ 1 ）材料、仪器酶标二抗 酶标抗体可直接购自生物试剂公司，亦可实验室标记。抗体的酶标记中， 酶的活性和纯度至关重要。 抗体也要求纯化程度高， 最好用亲和层析 纯化， 但在单抗标记中也可直接标记小鼠的腹水。 理想的结合剂应具备生产率高， 结合物稳 定，不影响酶的活性和抗体的活性， 不产生干扰物质、操作简便等条件。目前主要采用戊二 醛标记法和过碘酸钠标记法。戊二醛标记法的原理是通过它的醛基与免疫球蛋白上的氨基共价结合，即戊二醛上的两个活性醛基，一个与酶分子上的氨基结合，另一个与免疫示

7、蛋白上氨基结合，形成一个酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。标记过程可参见有关免疫学书籍。过碘酸钠法主要用于HRP的标记。 优点是标记率高， 未标记的抗体量少， 但结合物分子量较大，穿透细胞的能力不如用 戊二醛法标记的抗体，故不适于在免疫电镜中应用。包被液（NazCG 0.17g,NaHCO3 0.28g,加水至 100ml,pH9.6）PBS-Tween20洗液（0.5ml Tween20 ，1000ml PBS）封闭液（5g脱脂奶粉，加PBS-Tween20至100ml）酶底物（显色液） :柠檬酸 0.51g， Na2HPO412H2O 1.84g,OPD 50 mg, H2O2 160ul,

8、加水 至 100ml。抗原，待测血清。聚乙烯酶标板，微量加样器，振荡器，酶标仪。（ 2）操作步骤用包被液稀释抗原至合适浓度，加入酶标板，每孔50ul , 4C过夜或37C 1小时。弃包被液，PBS-Tween20洗涤3-5次，力口 100ul封闭液，4 C过夜或37 C 1小时。弃封闭液，PBS-Tween20洗涤3-5次，加待检血清（1:1000稀释）50ul , 37C保温1 小时。弃血清，PBS-Tween20洗涤3-5次，加酶标二抗 50ul , 37C保温1小时。弃二抗，PBS-Tween20洗涤3-5次，加显色液100ul,避光反应5-15分钟，每孔加 50ul 2M硫酸终止反应，酶标仪测量吸光值。（ 3）结果判断颜色反应超过阴性对照即可判为阳性。一般吸收值大于 0.2 的样品为阳性。 样品若作梯度稀释，仍然出现阳性反应的最高稀释度即为该样品的滴度。用P/N比表示亦可。样品的吸收值与阴性对照吸收值的比值大于2判为阳性。（ 4）注意事项应设置阴性