常见提取总DNA,RNA的方法与注意事项

1、提RNA可是电泳后什么条带都没有，用的是REDzol,是因为细胞太 少了还是别的什么原因， 在加了氯仿后没有出现 3 层，只有沉淀和上 清,是不是因为加氯仿到离心隔的时间太久了 参考见解：1、样品量太小；2、操作时没有严格按照提 RNA勺要求做，一般需要带手套，最好带 上口罩，所有塑料用品需要用DEPC处理并高压，要在超净台上操作， 尽量不让外源的RNA酶降解RNA3、 RNA电泳的电泳液和胶必须现配现用，并且要用DEPC处理，电 泳槽、制胶板先用蒸馏水洗涤然后用 75的酒精处理,还有,要单 独一个槽子跑, 不要和其他胶一起跑。 跑胶时间控制在 10 分钟左右。4、在加了氯仿后没有出现 3 层

2、,只有沉淀和上清, 可能是加的氯仿量不合适,一般是按氯仿 /mlTrizol 加氯仿的。从加氯仿到离心隔的 时间对这个应该没有影响。5、在提完RNA后可以测0D直，如果0D直在之间，说明提的 RNA 比较纯。RNA提取可不可以不用DEPC处理，多次灭菌（而不是长时间灭菌）也可以比较有效地灭活RNAse这种方法确实可行吗参考见解：DEPC主要目的是防止RNA酶,其实还有很多其他的方法处 理器皿的，如氯仿冲洗，NaOH处理,高温烘烤等另外两次灭菌也可以 代替DEPC处理.提RNA勺关键在于：防止内源性或外源性RNase降解 RNA对付外源性RNase有两种办法：能烤者烤，能泡者泡。比起其他的核酸实

3、验来说，就多这么一步。其二、RNase分子内部存在二硫键，一般条件变性后很快即可复性， 所以极为稳定； 而且其作用条 件“简单、快捷” 与绝大多数DNase不同，不需要二价阳离子即 可迅速发挥酶切作用。所以，要想长期保存RNA标本，DEPC处理溶液、Tip头等都是必不可少的。RNase一般高压不能灭活，如果不用 DEPC勺话，快速提取，快速使用，不能贮藏。3 个关于乙醇单词： ethanol ； alcohol ； mercaptoethanol ，他们的 主要区别是什么，可以互相代替吗参考见解： ethanol 是乙醇的专业名词，是用在医学，工业等方面， 主要是指工业酒精。 alcohol

4、也是乙醇，酒精的意思，但是主要是用 在饮食行业的名词。 mercaptoethanol 是巯基乙醇，不同于前两种， 是另外一种物质， 是一 种还原剂。RNA提取中DNA是怎么去掉的在哪一步呢 参考见解：在加入氯仿离心吸取上清的时候，注意不要吸到中间层。一般都要用DNase处理，即使吸不到中间层，也可能有 DNA亏染。 组织已经低温保存了一年多了，用来提 RNA可以吗参考见解：液氮中保存应该可以，但如果是在 -70C低温冰箱中则可 能降解，建议在液氮中保存时尽量将组织块切小，最好直径在 1CM 之内，有利于保存并方便下一步 RNA提取操作。当然如果条件允许， 可以将组织块放入 RNAlater

5、后低温保存，只要普通冰箱即可，方便 且效果很好。提取血细胞的RNA但血凝很快，应该注意什么问题是不是要加 EDTA用什么方法会更好参考见解：全血提DNA或 RNA要用抗凝血，可以用医院里采血管，里面已经 加了抗凝剂，或是自己配EDTAACD等来抗凝。EDTA抗凝用的溶液， 与血液之间体积比一般是 1:10 。ACD配方：单结晶水柠檬酸 （分子量），柠檬酸三钠（分子量）， 单结晶水D-葡萄糖（分子量），顺次溶于蒸馏水中，定容至1000ml, 过滤除菌。分装后20°C保存。抗凝血要用淋巴细胞分离液分离， 得到单核细胞后，再加入trizol等提取RNA步骤可按试剂盒操作 进行。如果不分离单

6、核细胞， 血里面的红细胞对提取有影响， 把红细 胞破坏掉也可以。采用淋巴细胞分离液分离外周血中的有核细胞, 经细胞裂解液处 理，上清提取RNA沉淀提取DNA用分离液分离所得红细胞沉淀制 备血红蛋白溶液。本法能从少量外周血中同时分离 RNA DNA及血红 蛋白，高效易操作，值得推广。怎样能更有效的降低材料的降解参考见解：1、新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么 降解几乎都来自裂解液的用量不足。 如果将裂解液直接加入培养皿中 裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。2、新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品 （如肝脏，胸腺等 ） ，即使 使用电动匀浆器匀浆也不能避免 RNA勺降解。更

7、可靠的方法是：在液 氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。3、冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至 -70C 冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于 -70C冰箱中。冷 冻样品， 即使是冷冻细胞， 如果不在液氮条件下研磨碎， 而直接加入 裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分 接触前决不能出现融化， 所以研磨用具必须预冷， 在碾磨过程中要及 时补充液氮。 样品研碎后， 在液氮刚刚挥发完时， 将样品迅速转移到 含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。4、外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验 系统。5、内源RNA酶的污染：抑制剂失

8、效或者用量不够，实验样品过多； 匀浆时温度过高。OD260/OD28比值偏低参考见解：1、蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量， 确保裂解完全、 彻底。加入氯仿后首先要充分混匀， 并且离心分层的 离心力和时间要足够。如果所得RNA勺OD260/OD28比值偏低，贝卩用 氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2、苯酚残留： 确保不要吸入中间层及有机相。 加入氯仿后首先要充 分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。3、多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量 较多，这些残留也会导致OD260/OD28比值偏低。因此，从这类材料 中提取RNA寸，需要注意多糖、多酚杂质的去除。4、设备限制：测定OD26C及OD28Q数值时，要使OD260卖数在之间。 此范围线性最好。用水稀释样品：测 0D值时，对照及样品稀释液请 使用10mM Tris，。用水作为稀释液将导致比值偏低。RNA提取得率低参考见解：1、该