高效液相层析法及其在生化研究中的应用ppt课件

1、高效液相层析法高效液相层析法 及其在生化研讨中的运用及其在生化研讨中的运用 03级 化学生物专业李楠 03081077 高效液相层析法HPLC,high performance liquid chromatography是近二十年来开展起来的一项新颖快速的分别技术。它是在经典液相层析法根底上，引进了气相层析的实际具有气相层析的全部优点。由于HPLC分别才干强、测定灵敏度高,选择性高，分析速度快，可在室温下进展，运用范围极广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不稳定的化合物均可用此法测定。对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。层析法的本质层析法的本质 色谱柱高选

2、择性的高效能的分别作用与高色谱柱高选择性的高效能的分别作用与高检测技术的结合。混合组分的样品在色谱柱中检测技术的结合。混合组分的样品在色谱柱中分别的根据是：同一时辰进入色谱柱中的各组分别的根据是：同一时辰进入色谱柱中的各组分，由于在流动相和固定相之间溶解，吸附或分，由于在流动相和固定相之间溶解，吸附或离子交换等作用的不同，随流动相在色普柱中离子交换等作用的不同，随流动相在色普柱中运转时，在两相间进展反复多次运转时，在两相间进展反复多次103103106106的分配过程，使原来分配系数具有微小差别的的分配过程，使原来分配系数具有微小差别的各组分产生了保管才干明显差别的效果。进而各组分产生了保管才

3、干明显差别的效果。进而各组分在色普柱中挪动速度不同，经过一定长各组分在色普柱中挪动速度不同，经过一定长度的色普柱后，彼此别分开，最后按顺序进入度的色普柱后，彼此别分开，最后按顺序进入信号检测器，在记录仪上或色普数据机上显示信号检测器，在记录仪上或色普数据机上显示出各组分的色普行为和谱峰数值。出各组分的色普行为和谱峰数值。 层析法可用于定性，半定量，定量的测定。其定性分析的根据是出峰的时间。而定量的根据是；组分分量或在在载气中的浓度与检测器的呼应信号成正比。此呼应信号指峰面积或峰高，表示为wi=fiAi, wi为欲测组分i的量， Ai为组分i的峰面积， fi为比例系数 称校正因子 高效液相层析法

4、的根本概念和分别实际与经典的液相色谱法及气相色谱法一致，因此其塔板实际及动力学实际等都可用于高效液相层析。 高效液相层析仪 典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用一高压泵输入。这种高压泵应满足以下条件： 流量恒定，无脉动，并有较大的调理范围。 能抗溶剂腐蚀。 有较高的输出压力，普通要到达15300kg/c，也有的高达800kg/c。 泵的死体积要小。梯度洗脱安装必需具备两泵的死体积要小。梯度洗脱安装必需具备两台高压泵，一台保送强溶剂，一台保送弱溶剂，台高压泵，一台保送强溶剂，一台保送弱溶剂，两泵运转速度用电脑控制，并可按一定的要求两泵运转速度用电脑控制，并可按一定的

5、要求改动流动相的组成，以改善分别效果。改动流动相的组成，以改善分别效果。 普通用微量注射器直接进样，也可采用六普通用微量注射器直接进样，也可采用六通阀门进样。通阀门进样。HPLCHPLC中所用的检测器最多运用的中所用的检测器最多运用的是紫外吸收检测是紫外吸收检测(UV)(UV)，灵敏度可达，灵敏度可达ngng程度。此程度。此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。学检测器等。高效液相层析仪的构造简图高效液相层析仪的构造简图 HPLC的类型与运用 液-固吸附层析： 固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。

6、液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为“底剂和洗脱剂两类，底剂起决议根本性谱的分别作用，洗脱剂起调理试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。流动相中底剂与洗脱剂成分的组合和选择，直接影响色谱的分别情况，普通底剂为极性较低的溶剂，如正已烷、环已烷、戊烷、石油醚等，洗脱剂那么根据试样性质选用针对性溶剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分别异构体、抗氧化剂与维生素等。 液-液分配层析：固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、枯燥活化、使外表坚持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对

7、原理的液-液分配层析为离子对层析。 化学键合层析分： 极性键合相层析：固定相为极性基团，氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，这称为正相层析法，适用于分别极性化合物。 非极性键合相层析： 固定相为非极性基团，如十八烷基C18、辛烷基C8、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体外表的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾景象。极性大的组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰好与正相法相反，故称反相层析。本法适用于小分子物质的分别，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生

8、物等。 离子交换层析： 原理与普通离子交换一样。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相 主要是水溶液，pH值最好在被分别酸、碱的pK值附近。 运用 高效液相层析法适用于分析沸点高，分子量大，热稳定性差的物质，它们约占全部有机化合物的80，如今高效液相层析法曾经在生物化学，生物工程，医药研讨，食品分析，环境污染分析和精细化工分析中广泛运用。 下面举几个例子核苷，核苷酸和核酸的分析研讨 在高效液相层析法开展中不断处于中心位置。嘧啶和嘌呤皆为含有N原子的杂环化合物，五种核碱皆在240280nm呈现强的紫外吸收特性，适于用UVD检测。反相键合相色谱作为检测DN

9、A合成的有效手段，已用于分析人工合成DNA碎片的组成。 在反相键合柱上核苷和核碱的分别在反相键合柱上核苷和核碱的分别abc(a)核苷的分别 (b)核碱的分别(C)核苷与核碱混合物的分别1-胞苷；2-尿苷；3-黄苷；4-肌苷(次黄嘌呤核苷)；5-鸟苷；6-胸苷；7-腺苷；8-胞嘧啶；9-尿嘧啶；10-次黄嘌呤；11-鸟嘌呤；12-黄嘌呤；13-胸腺嘧啶；14-腺嘌呤在在C18C18柱上分别核苷酸和核苷柱上分别核苷酸和核苷1-CDP；2-CMP；3-UMP；4-GDP；5-GMP；6-C；7-ATP；8-U；9-AMP；10-G生物胺Bioamine的分析研讨 生物胺是生物机体新陈代谢过程产生的胺类化合物，它们是由肾上腺髓质分泌的，既属于激素，又是神经递质。此类化合物的紫外吸收弱不适于生物样品的微量或痕量检测，现多利用柱前或柱后的荧光