RNA提取及组织匀浆

1、1、取组织块（0.2g1g ）最少可到 25mg ,在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤 纸拭干，称重，放入 5或10ml的小烧杯内2、2、用移液管量取预冷的匀浆介质 （ph7.4,0.01mol/L Tris-HCL, 0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L 蔗糖0.8 %的氯化钠溶液）或者用 0.86 %冷生 理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。3、3、匀浆的方式有多种：手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反

2、复冻融。4、手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有 冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（68分钟），充分研碎，使组织匀浆化。5、机器匀浆：用组织捣碎机1000015000r/min上下研磨制成10 %组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续35次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。6、超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150型超声波发生器以振幅 14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可

3、用国产超声波发生仪，用 40安培，5秒/次，间隙 10秒反复35次。7、反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。8、取少量组织匀浆做涂片（直接涂片、染色均可），显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可以延长匀浆时间或增加冻融次数。9、4、将制备好的10 %匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心1015分钟，若检测 ATP酶，则只需要1000转/分，离心5分钟，将离心好的匀浆留下 上清弃下面沉淀。10、 根据你的实验需要，取适量上清夜

4、进行各种测定TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA o TRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氟酸服/酚法、酚/SDS法、盐酸服法、硫氧酸服法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收 DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5X106细胞）也适用于大量样品（1g组织、10 7细胞）。对人，动物，植物组织，细

5、菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总 RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot, dot blot, ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于 RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase I处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的 DNA可用作标准，比较不同样品 RNA的得率， 也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于 Western Blotting 。规格：100ml黄色透明液体储存条件：28c避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量

6、水冲洗。忌用 乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。预防RNase污染注意事项：1 .经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2 .使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。3 .RNA在TRIzol试剂中时不会被 RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase的 塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 c烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水 彻底清洗，高压灭菌，即可去除 RNase。4 .配制溶液应使用无 RNase的水（将水加入处理过不含 RNase的玻璃瓶中，加入 DEPC至终 浓度0.01 %v/v,放置过夜，高压灭菌注：DE

7、PC有致癌之嫌，需小心操作）。RNA的提取5 .匀浆处理：a.组织将组织在液氮中磨碎，每50 100mg组织加入1ml TRIzol ,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过 TRIzol体积10%。b.单层培养细胞直接在培养板中加入 TRIzol裂解细胞，每10cm 2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的 RNA有DNA污染。c.细胞悬液离心收集细胞，每 510X106动物、植物、酵母细胞或 1X107细菌细胞加入1mlTRIzol ,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免

8、 mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。6 .将匀浆样品在室温（1530C）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。7 .可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于28 C 10000为离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量 DNA,上清中含 有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。8 .每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。9 . 2-8 C 10000为离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在

9、水相中，水相体积约为所用TRIzol试齐I的60%。10 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水 相中的RNA o每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。11 28c 10000均离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。12 用75 %乙醇洗涤 RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75 %乙醇。28c不超过7500沟离心5分钟，弃上清。13 室温放置干燥或真空抽干 RNA沉淀，大约晾510分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致 RNA的溶解性大大降低。 加入252

10、00 v比RNase的水或0.5 % SDS用枪头吸打几次，5560c放置1 0分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用 SDS溶液。RNA也可用100 %的去离子甲酰胺溶解， -70 C保存。注意事项：1 .从少量样品（110mg组织或102104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进 RNA沉 淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀 RNA前加510VgRNase -free糖原。糖原会与 RNA 一同沉淀 出来，糖原浓度不高于 4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2 .匀浆后加氯仿之前样品可以在 -60至-70 C保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75

11、%酒精 中28c一星期以上或-5至-20 C一年以上。3 .分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600X g离心3060分钟。预期产量：1mg组织或1X106细胞提取RNA分别为：肝和脾610Mg，肾34Vg ,骨骼肌和脑组织11.5 “g ,胎盘14Vg ,上皮细胞815 11 g,成纤维细胞57Vg。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底。B.RNA沉淀未完全溶解。A260/A280<1.65A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低 pH值条件下A280值偏高。B.样品匀浆时加的试剂量太少C.匀浆样品时未在室温放置5分钟D.吸取水相时混入

12、了有机相E.RNA沉淀未完全溶解。RNA降解:A.组织取出后没有马上处理或冷冻B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C,而保存在了 -5至-20CC.细胞在用胰酶处理时过度。D.溶液或离心管未经RNase去除处理E.电泳时使用的甲醛pH值低于了 3.5DNA污染:A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。蛋白聚糖和多糖污染:沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl ）混合离心，按之前操作进行。这种方法可使 蛋白

13、聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。DNA的分离准备试剂：乙醇0.1M柠檬酸钠（含 10%乙醇）75%乙醇8mM NaOH操作步骤：1.样品加氯仿分层后，移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置 3分钟，28 C不超过2000沟 离心5分钟。2 .移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含 10%乙醇的0.1M柠檬酸钠 洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置 30分钟，28 c 2000X g离心5分钟，弃 上

14、清，重复一次。3 .用75%乙醇再洗一遍 DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.52 ml75%乙醇，室温放置10 20分钟（不时颠倒混合）28 C2000为离心5分钟， 弃上清。4 .室温放置晾干 DNA 515分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从5070mg组织或107细胞 中分离的DNA溶于300 -600 g l 8mM NaOH , DNA的浓度通常为 0.20.3 g/21提取的DNA沉淀不易 溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解， 8mMNaOH的pH值为9,溶解DNA后可用TE , HEPES调 节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物

15、可 >1200OX g离心10分钟除 去。DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH 的DNA加水测A260值。一单位 A260值相当于50 g g/ml双 链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人、大鼠、小鼠1X106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1 g g, 6.5 g g, 5.8 Rg预期产量：1mg组织或1X106细胞提取DNA分别为肝和肾34Vg骨骼肌，脑组织，胎盘23Mg 人，大鼠，小鼠培养细胞(1X106) 57M g成纤维细胞57八。应用：1 .用于 PCR 溶于 8mM NaOH 的 DNA 用 0.1M HEPES 调 pH 至 8.4 ,取 0.1 1“g DNA

16、用作 模板。2 .酶切反应用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每gg DNA使用35单位的酶，80 90%的DNA是可消化的。1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节Final pH 0.1M HEPES ( g)l Final pH 1M HEPES ( g)l8.4 86 7.2 238.2 93 7.0 328.0 1017.8 1177.5 159注意事项：1 . DNA在中间层和有机相中时可在 28c保存过夜。2 .DNA沉淀在75%乙醇中28c可保存几个月。3 .DNA在8mM NaOH溶液中4 c可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至78并且加EDT

17、A至1mM,可置于4c或-20C长期保存。常见问题分析：得率低：A.样品匀浆和裂解的不彻底。8 .最终得到的DNA沉淀没有完全溶解。A260/A280<1.70A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了 TE中。9 .酚除去的不彻底，可用 0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍 DNA沉淀。DNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻。10 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C,而保存在了 -5至-20C。C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪。RNA污染：A.氯仿分层后水相去除的不干净B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗的不彻底。蛋白质的提取准备试剂：异丙醇含0.3M盐酸月M勺95%乙醇无水乙醇1%SDS o操作步骤：1 .取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。 每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置 10分钟，28 c 12000 Xg离心10分钟弃上清。2 .用含0.3M盐酸月M勺95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用 1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置 20分 钟，28C7500X g离心5分钟，弃上清，重复两次。用 2ml无水乙醇同样方法再洗一次。3 .真空抽干蛋白质沉淀 510分钟，用1%SDS溶解蛋白质