蛋白免疫印迹杂交WesternBlot技术手册

1、蛋白免疫印迹杂交Western Blot技术手册A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤， 总体原那么和考前须知：1:尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品2:保持蛋白的处于溶解状态通过裂解液的PH盐浓度 外表活性剂、复原剂等 的选择3:提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，低温操作，参加适宜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂4:尽量去除核酸，多糖，脂类等十扰分子通过参加核酸酶或采取不同提取策 略5:样品分装，长期于-80 C中保存，防止反复冻融。A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解

2、液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe推荐试剂盒 全细胞NP-40 or RIPA 附录1全蛋白抽提试剂盒细胞质可溶蛋白Tris-HCl附录1胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒 细胞质细胞骨架等不溶蛋白Tris-Triton附录1蛋白分级抽提试剂盒细胞质磷酸化蛋白磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA 附录1膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒 细胞核RIPA 附录1核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA附录1线粒体蛋白抽提试剂盒业细胞定位蛋白抽提试剂盒 细胞裂解操作方法：1培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解

3、液中参加蛋白酶和磷酸酶抑制剂 种类与量见本节22吸净PBS,参加预冷的裂解液，1 ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2flask.3用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，44 C摇动30 min54C离心12,000 rpm, 20 min根据细胞种类不同调整离心力6轻轻吸取上活，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃 沉淀.A-1-2组织裂解1用灭菌的预冷的工具别离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2将组织块放在圆底的微量离心管

4、或Eppendorf管中，参加液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-800C,3每约5 mg参加约300 l预冷的裂解液lysis buffer,冰浴匀浆后置于4C摇 动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，最终的蛋白浓度至少到达0.1 mg/ml,理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml.4 4C离心12,000 rpm, 20 min,轻轻吸取上活，转移至新预冷的微量离心管 中置于冰上，即为蛋白样本， 弃沉淀，A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂A-3蛋白定量Bradford法Lowry法或BCA法(均有商品化试剂盒可选择， 操作简单、需分 光光度计或酶标仪)，小牛血活白蛋白(BSA)作为标准曲

5、线。如果裂解液中有NP40或其它外表活性剂，那么推荐使用BCA法。A-4电泳上样样品的准备A-4-1变性、复原蛋白样本一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构(表位)，因此，为使抗体能够到达结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之翻开折叠的空间结构， 蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer (loading buffer),并于95-100 C煮沸5分钟，对于屡次跨膜蛋白，可以于70 C加热5-10分 钟，标准的上样buffer称为2X Laemmli buffer,上样时与样本！ ：！混合后变性上样即可：2X Laemmlibuffer 4% SDS10% 2-mer

6、captoehtanol20% glycerol0.004% bromophenol blue0.125 M Tris HClCheck the pH and bring it to pH 6.8.SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数 量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-PAGE电泳可将不 同分子量的蛋白别离开。A-4-2天然和非复原样本某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况那么需要进行非变性的WB,抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加SDS,样本 也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非复原态，如某些cysteine

7、基的氧化态，因此loadingbuffer和电泳液中不参加?-mercaptoethanol and DTT推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAILB电泳B-1 PAGE胶的制备聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根据蛋白分子量进行别离蛋白，PAGE胶是由两种化合 物聚合而成的，即丙烯酰胺acr和N,N-甲义双丙烯酰胺Bis.,聚合需参加过 硫酸铉及DMAP或TEMED ,凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔 径取决于总丙烯酰胺的白分含量T和交联度C , T%=a+b/m*100%;和C%=a/a+b*100%,其中：a=双体bis的重量；b=单体arc的重量；m=溶液的 体积m

8、l。丙烯酰胺总量增加，那么孔径减小，5%C构成最小的孔径，任何的%C增加或降低，孑L径都增加，凝胶的白分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺acr和N,N-甲义双丙烯酰胺Bis.的总量白分浓度w/voB-2蛋白分子量Marker预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪B- 3阳性对照目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查 阅文献或抗体说明书选择购置或自提该对照样本。B-4内参对照管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量

9、检测目的蛋白表达量的标准对照。 必 须设立。B- 3阳性对照目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取 物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性，特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书选择购置或自提该对照样本。B-5上样与电泳每孔上样量为20-40g蛋白，使用专用枪头或注射针头，勿溢出加样孔，标准电泳缓冲液：1X Tris-glycine:25 mM Tris base190 mM glycine0.1% SDS调pH;8.3.电泳时间按电流仪说明书推荐方法使用,1小时或过夜，取决于电压大小，当染 料到达胶的底部，关电源停止电泳，胶不能存放，应立刻进行下一步的

10、转膜。C转膜与显色Western BlotC-1胶中蛋白的检测电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如 果凝胶中的蛋白需要进行转膜那么需可逆的铜染法，否那么采用不可逆考马斯蓝法染色。铜染法：电泳胶用蒸僻水洗数秒钟，参加0.3 M CuCl2染色5-10分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带，胶置于0.1-0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开 始转膜。考马斯蓝法：用40%双蒸水，10%醋酸，50%甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯 蓝R-250染液凯基产品室温染色4小时至过夜，

11、保持摇匀，转入67.5%双蒸 水，7.5%醋酸,25%甲醇l摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。C-2蛋白转膜蛋白因结合SDS而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根据电转仪制造商的说明书进行转膜方式分为半十和湿转两种，半十式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白。湿式转膜三明治排列为：海绵/纸/胶/膜/纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之 间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确负极方为带负电的胶里的蛋白， 向 正极方膜电迁移。标准的电转缓冲液为1X Tris-glycine buffer不含SDS,但参加20%甲醇，如果 转膜的蛋白分子量大于80KD，

12、那么推荐参加SDS使之终浓度为0。1%。半十式转膜中，三明治的排列为：/纸/胶/膜/纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置 于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半十式的电转缓冲液可不同于湿式的电转缓冲液，推荐为：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇，两类膜可供选择：硝酸纤维素膜和PVDF膜正电荷尼龙膜，根据不同 需要选择下表，PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分钟，再孵育于冰冷的电转缓 冲液中5分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5分钟，否那么转膜时会导致条带变形。注：大蛋白和小蛋白的转膜电转移缓冲液中SDS与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都

13、会影响转膜效果， 如下调整可以增加转膜效率：大蛋白大于100 KD1.对于大蛋白而言，其在凝胶电泳别离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白。应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十 分小心。2大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此；转膜时在电转移缓冲液参加终浓 度为0.1%的SDS,以防止出现这种情况，甲醇易便SDS从蛋白上脱失，因此 应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。3降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。4如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必参加电转移缓冲液中

14、，但转膜前PVDF需用甲醇活化。5选择湿式,4C转膜过夜，以取代半十式转膜。小蛋白小于100 KD1 SDS阻碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子 的蛋白，电转移缓冲液中可以不加SDS。2保持20%的甲醇浓度。更多的转膜考前须知：?防止用直接接触膜，应使用镶子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易 产生背景污斑?排列三明治时，尽量用移液器或15ml试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三 明治放在装有的培养也中以防止气泡产生，请戴手套！?确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否刚导致电流不能通过膜，从而转膜 无效?鸡抗体易于与PVDF膜和其它尼龙膜结合，导致高背景，请替换成硝酸纤维

15、素膜以降低背景。C-3膜上蛋白的检测：丽春红 为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，2%的丽春红贮备液20ML:2%丽春红0.4克溶于30%三氯乙酸6克和30%磺基水杨酸6克丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液1: 10稀释，即加9倍的ddH2O染色方法：将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中，在室温下摇动染色5分 钟，大量的水洗膜直至水变活无色蛋白条带活晰，膜也可以用TBST或水重新洗后再进行染色PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。10 x TBS的配制：24.23 g Trizma HCl80.06 g NaCl加约800 ml超纯水用纯HCl调pH至7.6定容至1

16、L.TBST的配制：配制1 L TBST:量取100 ml 10 x TBS + 900超纯水+ 1ml Tween20Tween20非常粘稠，用枪头不易吸取，请确定参加准确的量，最好用Tris buffer.配成10%的Tween20母液后使用。C-4膜的封闭为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封 闭，传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或BSA,脱脂奶粉本钱低但不能用于磷酸 化蛋白(因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白)，使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。某些抗体用BSA封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号， 请仔细阅读说明书注明

17、的考前须知和膜 的特殊的封闭方法。配制5%脱脂奶粉或BSA溶液：每100 ml TBST中参加5 g脱脂奶粉或BSA,混匀后过滤，如不过滤会导致使膜污染上细微黑颗粒。封闭时，4。C摇动，封闭1 hour，再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。C-5一抗的孵育孵育Buffer:按抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释一抗，如果说明书没 有建议的稀释倍数，那么参照一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000),一抗浓度过高会 导致产生非特异性条带。某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含封闭剂的TBST来 孵育抗体，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时结果不同。注：如果不存在

18、高背景的问题，某些抗体用含低浓度(0.5 - 0.25%)脱脂奶粉或BSA的封闭液来，稀释，可产生相对更强的信号条带。孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜 (一般不超过18小时)不等，取 决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜， 应在4 C进行否 那么会产生污染而破坏蛋白(降别是磷酸基团)。孵育一抗时需保持适当的摇动使 之均匀覆没膜，防止结合不均匀。C-6二抗的孵育一抗孵育结束后，用TBST摇动洗膜数次，每次5min或更长，去除残 留的一抗。孵育Buffer和稀释倍数：用TBS

19、T按说明书推荐的倍数稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，那么按常规的倍数稀释(1:1000- 1:20,000)预试，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。亦可以在封闭液中孵育二抗(和一抗),但可能在降低背景同时导致特异性条带的信号也减弱，可能是封闭剂阻碍了抗体 与靶蛋白的结合。孵育时间和温度：室温、1-2 hours,摇动二抗连接物：推荐使用二抗连接HRP,不建议连接AP碱性磷酸酶，因其不够灵敏。C-7显色显色分为酶促底物发光和化学发光法或荧光法酶促底物发光法代表为DAB显色法附录1 WB实验试剂配方1Nonidet-P40 (NP40) buffer 150 mM sodium chlor

20、ide1.0% NP-40(或Triton X-100 )50 mM Tris, pH 8.02RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer) 150 mM sodium chloride 1.0%NP-40 or Triton X-1000.5% sodium deoxycholate0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate)50 mM Tris, pH 8.0注：The 10% sodium deoxycholate stock solution (5 g into 50 ml) must be prot

21、ected fromlight.3Tris-HCl buffer20 mM Tris-HCl, pH 7.54Tris-Triton buffer10 mM Tris, pH 7.4100 mM NaCl1 mM EDTA1 mM EGTA1% Triton X-10010% glycerol0.1% SDS0.5% deoxycholateAll four of these buffers will keep at 4 C for several weeks or for up to a year aliquottedand stored at -20 C.5TBS 10 x (concentrated TBS)24.23 g Trizma HCl80.06 g NaClMix in 800 ml ultra pure water.pH to 7.6 with pure HCl.Top up to 1 L.TBSTFor 1 L: 100 ml of TBS 10 x + 900 ml ultra pure water + 1ml Tween206PBS: 1.16 g Na2HP