荧光定量PCR引物设计原则

1、1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5端的300-400bp区域 内，可以用DNAman,Alignment软件看看结果。2.产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。3.引物长度一般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大。4. G+C含量在40%60%之间，45-55%最正确。5.碱基要随机分布，尽量均匀。6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。8.引物5端可以修饰。9.3端不可修饰，而且要避开ATGC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)。10.引物3端要避开密码子的第3位。11.引物整体设

2、计自由能分布5端大于3端，且3端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo 6软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计防止DNA污染，最好跨外显子接头区。14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。16. TM值在58-62度之间。17.引物设计的软件Primer 5.0有专门针对荧光的。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平

3、衡。设计引用有一些需要注意的根本原理：1引物长度一般引物长度为 1830 碱基。总的说来，决定引物退火温度( Tm 值)最重要的因素就是引物的长度。有 以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。在引物长度小于 20bp 时：4(G+C)+2(A+T)-5 C在引物长度大于 20bp 时：62.3C +0.41 C (%G-C)-500/length-5 C另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化 PCR 反响，使用确保退火温度不低于54 C 的最短的引物可获得最好的效率和特异性。总的说来，每增加一个核昔酸引物特异性提高4 倍，这

4、样，大多数应用的最短引物长度为18 个核音酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反响效率有关。由于嫡的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA 上形成供 DNA 聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。2GC 含量一般引物序列中 G+C 含量一般为 40%60%, 一对引物的 GC 含量和 Tm 值应该协调。假设是引物存在严重的 GC 倾向或 AT倾向那么可以在引物 5端加适量的 A、T 或 G、C 尾巴。3退火温度退火温度需要比解链温度低 5C,如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR 的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度， 是 DNA 双链结合。一对引物的退火温度

5、相差 4C 6C 不会影响 PCR 的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55C75 C 间变化。4防止扩增模板的二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验说明，待扩区域自由能AG小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。假设不能避开这一区域时，用 7-deaza-2-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。5与靶 DNA 的错配当被扩增的靶 DNA 序列较大的时候，一个引物就有可能与靶 DNA 的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST

6、软件进行检测，://BLAST/。选择Align two sequences (bl2seq), 如下列图BLAST 的使用方法也十分简单， 如下列图所示将引物序列粘贴到 1 区，将靶 DNA 序列粘贴到 2区，这两者可以互换的，并且 BLAST 会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的 GI 号也可以直接输入 GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在 3 处点击 Align 就可以查看引物在靶 DNA 中是否有多个同源位点了。可是使用 BLAST 还是有其不方便的地方。因为它一次只能比拟两条序列，那么一

7、对引物就需要分开进行比对。如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可 以直接将靶DNA 和引物输入对产物片段进行预测。6引物末端引物 3端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3端不应超过 3 个连续的 G 或 C,因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR (AS-PCR)反响中，引物 3端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。7引物的二级结构引物自身不应存在互补序列，否那么引物自身会折叠成发夹状结构，这

8、种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。假设用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应防止 3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8为了下一步操作而产生的不完全匹配5端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为 了下一步的操作就要作出适当的牺牲。很多时

9、候 PCR 只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR 这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。a添加限制性内切酶酶切位点 添加酶切位点是将 PCR 产物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5端还需要加 23 个保护碱基。但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：Sal I 不需要保护碱基，EcoRV 需要 1个，Not I 需要 2 个，Hind 山 3 个。其中，在原核表达设计引物时还有一些小技巧，大 家可以参考：原核表达之实验前的分析?。里面一些规那么是所有表达都通用的。有一种做法

10、是在进行 PCR 反响的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在 PCR 反响中的酶切反响率， 见附录。不过这种方法虽然方便但并不推荐。有时候，就是把PCR 产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。一旦出现问题，分析起来更麻烦。b LIC 添加尾巴LIC 的全称是 Ligation-Independent cloning，它是 Navogen 公司专门为其局部的 pET 载体而创造的一种克隆 方法。用LIC 法制备的 pET 载体有不互补的 12 15 碱基单链粘端， 与目的插入片段上相应粘端互补。 扩 增目的插入片段的引物 5序列要与 LIC 载体互

11、补。T4 DNA 聚合酶的 3 5外切活性经短时间即可在插入 片段上形成单链粘端。由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效， 而且为定向克隆。c定向 TA 克隆添加尾巴在 T 载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。但是后来人们发现TA 克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen 推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基 GTGG。因此在 PCR 引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以有方向了。d In-Fusion 克隆方法这项技术是 Clontech 还属于 BD 的时候推出的。此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长 时间的反响。只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR 产物和线性化的载体加入到含有 BSA 的 In-Fusion 酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。这种方法特别适合大批 量的转化。如果要参加额外的碱基总是或