三种荧光定量PCR检测方法比较

1、三种荧光定量PCR检测方法比较:以参照物为标准，对 PCR终产物进行分析或对 PCR过程进行监测，从而达到评估 样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在 PCR扩增的指数期进行的。常见检测方法可分为以下几类:(1) SYBR Green I检测模式SYBR Green I是一种能与双链 DNA结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后, 荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链 DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出 PCR体系存在的双链 DNA数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm ,发射波长最大约为 520nm 。 P

2、CR扩增程序一般为 94 C55 C72 C三步法,40个循环。SYBR Green I的缺点：由于 SYBR Green I没有特异性，不能识别特定的双 链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。SYBR Green I的优点：SYBR Green I的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。養性黄比整台SYBR. GRE-EN 1工作原理水解探针模式（man探针）而淬灭剂则在 3

3、 '末端。3'端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延TaqMa n探针是一种探针，荧光基团连接在探针的5 '末端,当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 伸反应时，聚合酶的 5'外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加， 释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧光。PCR扩增程序通常是：94 C60 C 40个循环。常用的荧光基团是FAM , TET , VIC ,HEX。I flHVA RDPW tMt It» - H(pe>niE B*

4、1 Wt Alii- Kr pve rI* 0( y rm* I i r H I t U IIII C O III |>ll <?t f? (JTaqman探竹L作原豐探针模式（Beacon、FRET）分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对,荧光基团被激发后产生的因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长,并相互配对形成茎的结构。 荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在

5、另一端。 在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时,因淬灭作用被解除，发出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团:FAM , Texas Red 。PCR 扩增程序通常是：945572 C三步法，40个循环。IMo'lecutar B&aconHybridQuercheTFluorophar分子借标I出惊理FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由两条相邻探针组成， 在一条探针的 5'

6、;端标记FAM荧光基团，另一探针的3'端标记Red 640荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，激发 FAM产生的荧光，作为 Red640基团的激发光被吸收，使Red640发出波长为 640的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远,不能产生640波长的荧光。由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。常用的荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705 。W "T -1 * P P * I" R S 1i», P - 1I r1 r I I - 1 - TT R ! s '1Danatur

7、ation5地仏 SJMMS *«EgjPrm段f tjina pfoteennea liriQ三 11汁.-TTTTI .十JLd _ 1 J：l I IhIj珀-FRET工作原理能用于实时荧光 PCR定量的方法很多，各有优缺点，应根据实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方法。下面为各种方法的比较:STBR OTEEKFKT |K<rTavin分手韻标n两"<：£ St熔倉竹祈褪;1邂别韵1們.二/卄r q呦山立hu诃1抚.计*恸-1 ?-|.也虽1杓=戏甘诅利；欄H1：嵩逐石婪蔚要通用炜Mt ,1.1廿t用实验中的一些好习惯:;移液枪用完之后要

8、归到最加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均 大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。一定要记着关水浴箱，切记切记 ；多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎 是最快提高的捷径了 ；所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因。防止污染的措施:1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180 C的高温下干烤6h或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐 蚀，故不能使用）。3. 有机玻璃的等，可先用去污剂洗涤， 双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室 温10min，然后用0.1% DEPC 水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能

9、的用 0.1% DEPC，在37 C处理12h以上。然后用高压灭菌除 去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22 m滤膜。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用，所有器械等应为专用。常用的RNA酶:1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）:是一种强烈但不彻底的 RNA酶抑制剂。它通过和 RNA酶 的活性基团组氨酸的咪唑环结合使，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的 RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使 RNA 酶失活。它既可破坏使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。RNA

10、酶结合形成3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和 过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）:从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种 RNA酶结合，使其失活。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA ,因此在分离和纯化 RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液（例如Tri）不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被

11、灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用 DEPC处理动植物总RNA提取-Trizol法:Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几 克。用Trizol法提取的总 RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Pol y(A)+分离，体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。1.将组织在液N中磨成粉末后，再以 品总体积不能超过所用Trizol体积的10% 。50-100mg组织加入1

12、ml Trizol液研磨，注意样2. 研磨液室温放置 5分钟，然后以每离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。ImlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧3. 取上层水相于一新的离心管，按每 室温放置10分钟，12000g离心10分钟。ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,4.弃去上清液，按每 ml Trizol液加入至少1ml 下7500g离心5分钟。的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4 C5.小心弃去上清液，然后室温或真空干燥 5-10 低RNA的溶解度。然后将 RNA溶于水中，必要时可 行mRNA分离，或贮存于 70%乙醇并保存于-70 C。分钟，注意不要干燥过分，否

13、则会降55 C -60 C水溶 10分钟。RNA 可进注意1.整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。质污染,另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白 影响比值2.存一周，加氯仿前的匀浆液可在-70 C保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 C保-20 C保存一年。mRNA的提取经验:关于Trizol Reage nt 需要的试剂1. Chloroform :氯仿(分析纯)2. Iso prop lyl alcohol :异丙醇（分析纯）3. 75% Ethanol（in DEPC-treated water） : 75%乙醇。要求用分析纯

14、无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无 Rnase的水稀释。4. RNase-free water :无 Rnase 的水。方法是：将 DEPC 按 0.01%（V/V）加在 d H2O 中500ml（50ul），在37 C过夜，并高压灭菌即得（150 C 3小时）5.一次性塑料手套6.注意：DEPC有致癌之嫌关于Trizol Reage nt的使用过程:1. Homoge ni zati on（ 匀浆）a. Tissues :组织每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。b. Cells Grown in mo nolayer（单层细胞接毒后

15、出现病变的）针对JEV细胞总RNA的抽提法:BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37 C吸附1h，倒掉，加维持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）约5ml，维持天。出 现75%-100%的病变时，以 PBS（预冷） 冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞 （细胞以盖满瓶底为度，而不是依据细胞的数量,（样品一定要新鲜）瓶有两 种常用规格：大的约 45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.5ml 和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定， 否则可导致DNA的污染）具体方法如下：（1）组织接入预冷的

16、 EP管中，加入 染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温Trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，否则易污5min，以使核蛋白复合物彻底分离。（2）加氯仿0.2ml（每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，剧烈震荡 15s，置室温2-3分钟。（3） 4 C离心，10000g X15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。 RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的 60%。（4）仔细吸取上层水相，移至另EP管中。 加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10m

17、in。4 C离心，10000g X10min 。 RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。（7）弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml）,震荡，充分洗涤沉淀，4 C离心，5500gx 5min。弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无 Rnase dH2O 中，吹吸几次，55 C -60 C作用10分钟以溶解 RNA , -70 C保存备用。(8)抽提出的细胞总 RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100 倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以无 Rnase水为对照，在721型紫外分光光度

18、计 下检测，结果应为： A260/280 ratio<1.6 。(9) 分离组织 10mg( 纯组织 ) 加 800ul Trizol 试剂。(10) 扩增产物的鉴定。DEPC 处理方法如下：1. DEPC 处理：(1)DEPC 水： 100ml 超纯水加入 0.2ml DEPC ，充分混匀，高压灭菌。(2)Tip头(枪头)、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材(包括1ml、200卩、20卩I Tip头;EP管和PCR反应管等)：用0.1%的DEPC水(1000 ml超纯水加入1mlDEPC)37 C浸泡过夜，高压灭菌。2. 提取 RNA ，用 DEPC 水溶解。3. RT

19、 ：我是用 PCR 仪来控制温度和时间的，所以 RT 是在 PCR 反应管中作的。4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。最好把要直接接触样品的东西都用 DEPC 水处理一下， 枪头盒插好枪头后， 加入 1-2ml 的 0.1%DEPC 水，在灭菌就行了 ;现在有进口的 RNASE FREE 的枪头买，直接用不用处理 的。如何消除污染：机器运行完后， 取出 PCR 产物时不能随便丢弃， 应该用塑料手套或其他打结包好后丢 入垃圾桶。(1) 试剂： mixer 尽量分装，不要原瓶多次取用。(2)加样：原则是 DNA 最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引 物和探针有多管的话只

20、是 DNA 不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面， 混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG 来防污染。 Uracil-DNAN-glycosylase(UNG) 尿嘧啶 DNA 糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。RNA 定量：RNA 也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度 计比较 不同标本之间就更不准了。RNA 降解速度的影

21、响。RNA 的贮藏，最主要的是温度， -20 不够，最好 -80，液氮最保险。mRNA 是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和PCR。RT-PCR 有两种做法：条件具备的话可用 kit 进行一步法进行 ;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，由此推测是体系更加单一比较利于RT-PCR 做的PCR 的进行。一定要做内参的，不作内参的结果是不可信的。电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量都是基因相对表达量，不是绝对表达量 mRNA 的分离与纯化中。坏 RNA 的二级结构，尤其是 mRNA Poly(A+) 尾处的二级结构

22、， 从而提高 Poly(A+)RNA 的回收率 ;另一个目的是能解离 mRNA 致 rRNA 的污染。所以此步骤不能省略。RNA 酶的方法。步骤(4)中将RNA溶液置65 C中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破 使 Poly(A+) 尾充分暴露， 与 rRNA 的结 合，否则会导面，我们介绍一个可以确认 RNA 溶液中有没有残留的保温试验：方法很简单的，按照样品浓度， 从 RNA 溶液中吸取两份 1000 ng 的 RNA 加入至 0.5 ml 的离心管中， 并且用 pH7.0 的 Tris 缓冲液补充到 10 ul 的总体积， 然后密闭管盖。 把其中一 份放入70 C的恒温水浴中

23、，保温1 h。另一份放置在-20 C冰箱中保存1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两 者的条带一致或者无明显差别 (当然，它们的条带也要符合方法 2 中的条件 )， 则说明 RNA 溶液中没有残留的 RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果 70 C保温的样本有明显 的降解，则说明 RNA 溶液中有 RNA 酶污染。PCR 污染与对策：PCR 扩增产物污染 .这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题，所以，扩增区的仪器 什么如枪头等要注意。还有一种容易忽视，最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染 ;在空气与液体面 摩擦时就可形成气溶胶， 在操作时比较剧