旋毛虫与小鼠Lewis肺癌细胞相关抗原筛选及其抗血清抗肿瘤效应的研究

1、旋毛虫与小鼠 Lewis 肺癌细胞相关抗原筛选及其抗血清抗肿瘤效应的研究肺癌是发病率和死亡率增长最快、 对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肿瘤生物治疗被认为是癌症新兴疗法, 包括靶向治疗、免疫疗法、基因疗法等 , 随着生物技术发展, 研究发现一些寄生虫感染也具有抗肿瘤作用 , 其中在 20世纪 70 年代时研究人员就发现了旋毛虫感染具有抗肿瘤作用。近年来研究发现旋毛虫抗原对多种月中瘤生长具有抑制作用,如H7402肝癌、MCF<sub>7</sub乎L腺癌、Sp2₀#ffi瘤、Hela 宫颈癌和 A549肺癌等。在肺癌研究中裸

2、鼠肿瘤模型是常用动物模型之一, 但因裸鼠为免疫缺陷小鼠 , 缺乏完整的免疫系统, 肿瘤在其体内的发生发展与肿瘤正常发生过程差异较大, 数据参考价值有待商榷。小鼠Lewis肺癌模型是肺癌研究中常用的另一小鼠模型,它是将LLC细胞接 种于SPF级C57BL/6小鼠而建立，荷瘤过程经历了小鼠的正常免疫应答。该模型 更接近于肿瘤的正常发生过程, 在肺癌的发病机制、药物治疗和生物治疗等研究中发挥重要作用。而目前 , 关于旋毛虫与小鼠Lewis 肺癌 （ LLC） 细胞之间相关抗原及其抗血清的抗月中瘤作用尚未报道。本试验对旋毛虫肌幼虫cDNAS达文库进彳T免疫筛选，获取了旋毛虫与LLC细胞相关抗原sHSP

3、s,原核表达，检测该相关抗原sHSP咻外 对LLC细胞的作用，并制备sHSPs抗血清，对荷瘤小鼠模型治疗，观察其抗月中瘤效 应。通过细胞因子和免疫组化检测，分析旋毛虫sHSPs抗血清抑制小鼠Lewis肺 癌细胞生长机制 , 为深入研究旋毛虫抗肿瘤机制和肿瘤治疗药物的研发提供参考。旋毛虫与LLC细胞相关抗原sHSPsR血清的体内抗月中瘤效应LLC细胞悬液接清为阳性血清筛选旋毛虫肌幼虫 cDNAft达文库,经筛选将获得的阳性噬菌斑进 行PCRT增，并对扩增产物进行测序。与Genbank中公布旋毛虫基因序列比对后获得 4个旋毛虫与LLC细胞相关抗 原基因Tsp<sub>0</sub

4、>9334、 Tsp₀7696 、 Tsp₀9092 、DQ986457.1,经生物学分析后发现编码旋毛虫小热休克蛋白(sHSPS的DQ 986457.1 基因具有多个亲水区及抗原表位, 因此选取该基因进行下一步试验。 根据比对获取的旋毛虫sHSPsS因序列设计特异性引物，以旋毛虫肌幼虫cDNM模 板,PCR扩增sHSPs®因，并将其连接至表达载体p ET-32a (+)进行原核表达， 获得重组sHSPs。用锲柱亲和层析法纯化sHSPs,免疫小鼠制备抗血清。Western blot鉴定

5、sHSPs,结果显示sHSPT LLC细胞全蛋白抗血清可发生特异性结合反应，说明 sHSPs#有良好反应原性。间接免疫荧光试验对sHSPs抗血清进行鉴定，结果显示sHSPs抗血清与LLC 细胞可以发生结合反应。旋毛虫与LLC细胞相关抗原sHSPs体外对LLC细胞的作 用检测LDHff放情况分析sHSPsXt LLC细胞活性的影响，结果显示随着sHSP舔 度增大,LLC细胞死亡率增大，说明sHSPs对LLC细胞具有毒性作用。利用CCK-8法检测sHSPs对LLC细胞增殖的影响，结果表明LLC细胞存活率 随着sHSPs浓度增大而减小，说明sHSPs对体外LLC细胞增殖具有抑制作用。采 用 West

6、ern blot 检测肿瘤细胞凋亡相关蛋白 caspase-3 表达情况 , 结果显示 sHSP/浓度组未见caspase-3活化片段，说明sHSPs对LLC细胞的增殖抑制可能不是由 caspase-3 引起的凋亡发挥作用。种于 C57 BL/6 小鼠前肢背部皮下, 建立小鼠 Lewis 肺癌肿瘤模型。小鼠接种 LLC细胞7天后，用sHSPsK血清对荷瘤小鼠进行治疗,连续治疗7天后,将小鼠处死, 剥离肿瘤称重, 测量体积 , 计算抑瘤率。结果表明，sHSPs抗血清具有抑制小鼠Lewis肺癌细胞生长的作用，最高抑瘤率为 69.23%。ELISA检测 IL-4、IL-10、IFN- 丫 和 TNF-a 水平无差异,发现 sHSPs抗血清可能并非调节这些细胞因子发挥抗肿瘤作用 ; 免疫组化分析治疗后各组小鼠肿瘤组织细胞中增殖凋亡相关基因