出血性大肠杆菌(EHEC)O157H7效应蛋白NleL和宿主蛋白ZBED1相互作用的发现与验证

1、出血性大肠杆菌(EHEC O157:H7效应蛋白NleL和宿主蛋白ZBED1相互作用的发现与验证出血性大肠杆菌(EHEC O157: H7是一种食源性和水源性的病原菌，该菌 通过III型分泌系统将效应蛋白注入至宿主细胞中产生粘附与脱落(A/E)损伤而致病，它的感染会导致出血性肠炎并极有可能出现致命的出血性尿毒综合症，是一种全球范围内高度关注的病原菌。 NleL(non-lee-encoded-effector-Ligase)是由田型分泌系统分泌的一种具有真核细胞泛素化E3连接酶活性的效应蛋白，然而它在宿主细胞内的底物和作用机制尚不清楚。本文通过蛋白质表达重组子的构建、 蛋白质的诱导表达与纯化、

2、 蛋白质细胞内定位、酵母双杂交、 GSTpull-down 和体外泛素化等实验方法来筛选和验证效应蛋白 NleL 在真核细胞内的相互作用蛋白，取得了以下结果： 1. 酵母双杂交实验筛选NleL可能作用于宿主的底物蛋白ZBED情母双杂交实验初次筛选出可能与效应蛋白NleL相互作用的真核宿主细胞蛋白 ZBED1在SD-2和SD-4板均能生长的阳性克隆，经扩增、双酶切、测序分析比对后，发现的确是ZBED仔列，可初步推断宿主蛋白ZBEDW效应蛋白NleL之间有可能存在相互作用。2.NleL(GST-NleL)蛋白的诱导表达与纯化本研究成功纯化了带有 GS杯口 His双标签 的NleL的全长蛋白GST-

3、NleL-His和其带单标签的片段 GST-NleL170-782-WT蛋 白。结果表明，在纯化方法上用 GST-beads纯化方法优于用Ni-NTA方法；纯化 获得的 NleL 融合蛋白的纯度和质量也满足进一步实验的要求，融合蛋白可以冷冻储存为后续体外实验备用。3.效应蛋白NleL与宿主蛋白ZBED许合试验用GST pulldown试验验证了宿主蛋白ZBED1W效应蛋白NleL的相互结合，westernblot检测显示蛋白 GST-NleL-His与NleL蛋白的片段 GST-NleL170-782WT#B与宿主蛋白ZBED傣体外产生较强白相互结合，由 ZBEDW GST-NleL170-7

4、82WT 的相互结合可以推测：效应蛋白 NleL与宿主蛋白ZBED价目互结合的位点有可能 位于第 170-782 氨基残基之间。4.效应蛋白NleL与宿主蛋白ZBED1的体外泛素化试验已有研究显示 NleL 具E3连接酶活性，且具泛素化的活性与第 753位的半胱氨酸残基有关，本研究 通过NleL与ZBED侑3卜泛素化实验探究了 NleL是否通过该活性作用于底物 ZBED1结果表明，宿主蛋白ZBED1#在自泛素化现象，NleL全长蛋白融合蛋白 GST-NleL-His、NleL 的第 753 位点突变片段融合蛋白 GST-NleL170-782C753A 底物ZBED1白相用后，ZBED1的自泛

5、素化作用明显减弱，效应蛋白NleL可能是通过影响宿主蛋白ZBED1的自泛素化作用而影响宿主细胞的生理活动； NleL的第753位点突变片段融合蛋白 GST-NleL170-782C753AW未突变的全长蛋 白作用效果相同，表明NleL蛋白不是通过E3连接酶的活性来影响ZBED1的生理 作用的。5.效应蛋白NleL在真核细胞内的表达与定位明确效应蛋白NleL在细胞内的定位对于探究其在真核细胞中的作用机制是十分必要的。 本研究成功构建出能够 在真核细胞中表达带EGFP勺NleL融合蛋白重组质粒 pCDNA3.0-UTR-EGFP-NleL-HA等该质粒和对照质粒 pCDNA3.0-UTR-EGFP-HA染 293T 和 Hela 细胞后，观察显示NleL 蛋白绝大多数定位在细胞质内，亦有少量进入到细胞核中；对照组 EGF限光蛋白在整个细胞中均有分布，没有明显的细 胞定位特异性。由此可推测， NleL 效应蛋白进入真核细胞后，可能在细胞质中和细胞核中与不同的底物蛋白发挥不同的作用。 总之， 本研究通过酵母双杂交系统首次成功筛选到效应蛋白 NleL 在宿主细胞中的潜在底物ZBED1， 并且通过 GSTpu