基因工程重组蛋白的分离纯化放映ppt课件

1、基因工程重组蛋白的分别纯化生物工程下游技术第七组马夕尧意义？ 生物工程以基因工程为中心，主要产品为蛋白质或多肽。经过多年的努力，我国基因工程“上游已与国外差距减少，但“下游技术，尤其是蛋白质纯化处置与先进国家相比， 仍有很大差距。目录 一获得基因工程产品的特点一获得基因工程产品的特点 二建立蛋白质纯化工艺的根据二建立蛋白质纯化工艺的根据 三蛋白质分别纯化应遵顺的原那么三蛋白质分别纯化应遵顺的原那么 四分别纯化的根本过程四分别纯化的根本过程 五几种主要蛋白质分别纯化的方法优缺五几种主要蛋白质分别纯化的方法优缺陷对比陷对比一获得基因工程产品的特点 目的产物在初始物料中含量低，而且往往在细胞内。含目

2、的产物的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还含有大量的细胞、代谢物、残留培育基、无机盐等，特别是产物降解酶、产物类似物等对目的产物的分别影响很大。.目的产物普通是大分子物质，稳定性差，具有生物活性的物质对pH值、温度、金属离子、有机溶剂等非常敏感，容易失活、变性；.种类繁多，包括有大、中、小分子，构造简单或复杂的有机化合物以及构造复杂又性质各异的生物活性物质。对这些大分子基因工程产品的纯化缺乏必要的数据，似乎每种蛋白都有其单独的纯化方案，放大也往往凭阅历，不像抗生素等小分子物质有很多数据可指点放大。.运用面广，往往是注射用，对其质量、纯度要求高，无菌、无病毒、无热原。 二建立蛋白质纯化工艺的根

3、据2.1目的蛋白的各种性质目的蛋白的各种性质分子量大小，大的蛋白质先过凝胶柱；分子量大小，大的蛋白质先过凝胶柱；分子外形，球蛋白易分散人凝胶过滤柱填分子外形，球蛋白易分散人凝胶过滤柱填料颗粒的小孔内，较迟洗脱出来；料颗粒的小孔内，较迟洗脱出来；电荷与电荷分布，与离子交换严密相关；电荷与电荷分布，与离子交换严密相关；疏水性，与疏水层析、反相高压色谱有关；疏水性，与疏水层析、反相高压色谱有关；.溶解度，影响要素有溶解度，影响要素有pH值、离子强度、离值、离子强度、离子的性质、湿度和溶剂极性等，可用于沉子的性质、湿度和溶剂极性等，可用于沉淀分别；淀分别；密度，磷蛋白等密度大，可用密度梯度法密度，磷蛋

4、白等密度大，可用密度梯度法分别；分别；配体结合才干，用于亲和层析；配体结合才干，用于亲和层析；金属结合才干，用于鳌合有金属离子的亲金属结合才干，用于鳌合有金属离子的亲和柱；和柱；翻译后修饰，如连有糖基的蛋白可用于含翻译后修饰，如连有糖基的蛋白可用于含有外源凝集的亲和柱，磷蛋白质在某些糖有外源凝集的亲和柱，磷蛋白质在某些糖基下能与鳌合有基下能与鳌合有FeZ的柱子结合。的柱子结合。2. 2物料中杂质的种类和性质物料中杂质的种类和性质 包括杂质的种类和含量、化学性质、分子构造、相对分子量、电荷性及数量、生物学特性、稳定性(对于热、pH值、盐、有机溶剂等)、溶解度、吸附性能等。2. 3初始物料的特点初

5、始物料的特点菌种类型及其代谢特性，包括菌种表达方式(能否以包含体方式)、副产物种类、产物类似毒素、蛋白酶种类、原资料和培育基的来源及其质量；消费工艺和条件，包括灭菌方法和条件、消费方式(延续、批式、半延续)、消费周期、消费才干、工艺控制条件、要素及方式等；初始物料的各种性质，包括产物浓度、杂质种类、浓度变化、盐的种类、浓度、溶解度、pH值、粘度等。2.4产质量量的要求产质量量的要求 产质量量规范和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。 包括允许杂质种类和最大允许含量，特殊杂质种类和最大允许量。 以及杂质对运用的影响、产品剂型、储存稳定性等。 三蛋白质分别纯化应遵顺的原那么具有良好的稳定性和反复

6、性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原资料来源的影响，使产品规格一致。必需明确严厉控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。步骤之间尽量能衔接，减少工艺的步骤，同时工艺与设备也要相互顺应，普通分别原理一样的技术在工艺中不要反复运用，既可减少周期，又能提高纯度和得率。技术条件要温暖，温度低，PH值适中，能坚持目的产物的生物活性。工艺过程中要尽能够少用试剂，以免添加分别纯化步骤或干扰产质量盆。周期尽量短，因稳定性差的产物随工艺时间添加，收率、质量会下降。目的蛋白质选择性好，能从复杂的混合物中将目的产物有效地分别出来，到达较高纯化倍数。工艺和技术必需快速高效、收率高、易操作、对设备条件要求低、能耗低。具有

7、较高的平安性。在选择处置技术，工艺和操作条件时，要确保去除有危险的杂质，保证产质量量和作用平安以及消费过程的平安，药品消费必需保证平安、无菌、病毒、热原。四分别纯化的根本过程 样品的固液分别与预处置样品的固液分别与预处置 基因工程药物多为胞内产物，分别提取这类物质时，基因工程药物多为胞内产物，分别提取这类物质时，需求经细胞搜集细胞破碎细胞碎片分别等步骤需求经细胞搜集细胞破碎细胞碎片分别等步骤 层析纯化层析纯化细胞破碎针对这种构造，细胞破碎方法有机械破碎法和非机械破碎法，可以根据消费规模和活性蛋白在细胞中的位置，选择适当的方法。机械破碎法是常用的方法，速度快，处置量较大，不会带人其他化学物质，但

8、在处置过程中产生热量，必要时要采取冷却措施，以防止目的产物失活。现常用方法有高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法。非机械破碎法包括酶溶法、化学浸透法、热处置法、浸透压冲击法。酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖昔酶、肤链内切酶、壳多糖酶等。溶菌酶对细菌类作用效果好，其他酶对酵母作用效果好。利用酶溶法处置细胞时必需根据细胞的构造和化学组成选择适宜的酶.并确定相应的运用次序，控制好温度、pH值和酶量。化学浸透法利用一些有机溶剂(苯、甲苯)等可以改动细胞壁或细胞膜的通透性，从而使内含目的产物有选择地浸显显露来。细胞壁是由巩固的多聚

9、糖、乙酸葡萄糖胺和乙酞胞壁酸所构成的网状构造，具有一定的韧性。分别细胞碎片分别细胞碎片是比较困难的，可以用离心、膜过滤或双水相分配的方法，使细胞碎片分配在一相(通常为下相)而分别，同时也起部分纯化作用；得到的上清液可以经过硫酸氨分级沉淀、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、超滤浓缩脱盐等进展预处置，有些可以进展特殊处置，如加热、三氯乙酸处置等除去杂蛋白。以枯草杆菌、毕赤酵母等作为基因工程菌的话，由于都是外分泌，直接用离心、过滤等方法进展分别，可以加人一些助滤剂等利于分别。层析纯化层析纯化预处置的产物能够仍与大量的杂质混合在一同，这类杂质能够有病毒、热原质、氧化产物、核酸、多聚体、杂蛋白、与目的物类似的异

10、构体等。进一步纯化主要依赖色谱分别方法，其优点是具有多种多样的分别机制，便于自动化控制和分别过程中无发热等有害效应。层析纯化方法设计应根据目的蛋白和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差别，尤其重要的是外表性质差别，例如外表电荷密度、对一些配基的生物学特异性、外表疏水性、外表金属离子、糖含量、自在疏基数目、分子大小和外形(相对分子质量)，pl，和稳定性等。选用的方法应能充分利用目的蛋白和杂蛋白间上述差别离子交换色谱离子交换色谱(ion exchange chromatography , IEC )疏水色谱疏水色谱(hydrophobic interaction chromatography,H

11、IC)亲和色谱亲和色谱(affinity chromatography, AC )。凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱五五.几种主要蛋白质分别纯化的方法几种主要蛋白质分别纯化的方法优缺陷对比优缺陷对比方法方法原理原理优点优点缺点缺点特点特点基于分子大小差基于分子大小差异的分离技术异的分离技术凝胶层析（又称凝胶过滤、分子筛层析或排阻凝胶层析（又称凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析）层析）利用凝胶的网状结构，根据分子大小差异分离混合物的方法。条件温和、简便、分离范围广、回收率高,对生化物质的分离十分适宜该法上样量有限常用在纯化的最后一步，与其他分离方法( 如离子交换) 组合使用超滤超滤利用加压膜分离技术，在一定

12、的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜，大分子溶质滞留，从而使大分子物质得到部分的纯化超滤技术作为一种典型的膜分离技术，则具有高效率、低能耗、无相变、无需添加任何化学试剂、操作简便、条件温和等诸多优点超滤膜缺乏选择性以及在超滤过程中易产生浓差极化与膜污染在超滤过程中，所用超滤膜的孔径约为1 100 nm，截留相对分子质量( molecular weight为 3105 1106，能用于蛋白质、细菌、胶体、病毒、热原、多糖等的分离透析透析透析是利用小分子经过半透膜扩散到水( 或缓冲液) 的原理，将无机盐等小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术，常和盐析、盐溶等方法联合使用透析结果表

13、明，大的蛋白质分子和小的氨基酸分子得到初步分离。必须利用不同型号透析袋，通用性不好根 据 目 的 蛋 白 的 分 子 大 小 来 选择透析袋的型号。基于溶解度差异基于溶解度差异的分离纯化技术的分离纯化技术等电点法等电点法利用蛋白质在等电点时溶解度最低且各种蛋白质等电点不同的特点进行分离的方法该法具有操作简单，提取率高产率高等优点，提取率有时可达80%以上不少蛋白质与金属离子结合后，等电点可能会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整pH值。为了沉淀目的蛋白，把溶液的pH调到目的蛋白的等电点即可溶剂法溶剂法溶剂提取法包括水溶液提取法和有机溶剂提取法，其中缓冲溶液对蛋白质的溶解度大、稳定性好

14、，最为常用; 而乙醇、丁醇和丙酮等有机溶剂具有一定的亲水性和较强的亲脂性，主要用于一些脂质结合较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶乙醇提取法溶解性能较好、溶出的水溶性杂质少、可回收反复利用。丁醇在一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶提取中更加优越，溶解脂的能力强，兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。缺点是对具有生物活性大分子易引起变性失活，操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。双水相萃取法双水相萃取法它把两种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起，由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不溶性形成两相与传统的分离技术相比，具有操作条件温和、处理量大、易连续操

15、作等优点，同时克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用，在粗提过程中保持了生物物质的活性及构象等优势。该技术现已成功地应用于分离蛋白质、抗生素微生物离子、电泳分离氨基酸等采用双水相系统浓缩目的蛋白，受聚合物分子量及浓度、溶液 pH、离子强度、盐类型及浓度的影响双水相萃取技术是一种新型的分离技术反胶团萃取反胶团萃取指胶团内可溶解少量水而形成微型水池，利用胶团对外界有机溶剂的屏蔽作用，实现生物物质的溶解和分离具有选择性高、萃取过程简单，正萃、反萃同时进行，能有效防止大分子失活、变性普通离子型表面活性剂可能对产品产生污染; 常用的离子型表面活性剂容易造成蛋白质的变性和失活，虽然活性损失较少其影响因

16、素主要包括表面活性剂种类以及浓度、离子强度、助表面活性剂、水相 pH 和温度等。 反胶团萃取法还可提取蛋白质、酶、核酸、氨基酸和多肽。盐溶法及盐析法盐溶法及盐析法许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，该现象称为盐溶，而当盐浓度继续增加时，蛋白质又会自动析出，该现象称为盐析。盐溶和盐析主要是通过影响蛋白质分子表面的电荷而分离、纯化蛋白质盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，常用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐。硫酸钠具有化学性质稳定、溶解度大等优点，现在所指的盐析法实际上多为硫酸铵盐析法该法受蛋白质浓度、离子强度、盐的性质、pH 及温度等因素影响上述两种方法分

17、离纯化蛋白质后，都要采用凝胶过滤或透析除盐基于电荷不同的基于电荷不同的分离技术分离技术离子交换层析离子交换层析离子交换层析以纤维素或交联葡聚糖凝胶等物质的衍生物为载体，在某一 pH 条件下，这些载体带有正电荷或负电荷，当待分离蛋白质分子通过载体时，离子交换使蛋白质分子分离纯化机械强度大、柱效高、孔径和颗粒大小易于控制，但应用范围窄不能进行快速淋洗，且分离时间长，易造成生物分子的变性、失活离子交换层析是发展最早的层析技术之一，目前已成为蛋白质分离纯化最常用的手段电泳技术电泳技术电泳技术作为分离纯化蛋白质的手段之一，可分为变性电泳、常规电泳、等电聚焦电泳和毛细管电泳。无论是单向凝胶电泳还是双向凝胶

18、电泳，分离度都是极高的。毛细管电泳中蛋白质易被石英毛细管表面所吸附，且一次只能测一个试样。获得分离的蛋白质，均可用电洗脱或电转印到硝酸纤维素膜上直接进行序列分析基于对配体亲和基于对配体亲和力差异的分离技力差异的分离技术术亲和层析亲和层析亲和层析是一种以样品的生物活性为依据的分离技术；当蛋白质溶液通过层析柱时，其中可与亲和载体配基相互作用的受体被吸附剂结合，不被吸附的无关成分则可随流出液通过柱体，从而将吸附蛋白与其他蛋白质分开，而后利用高浓度的底物溶液或亲和力更强的底物衍生溶液洗脱目标蛋白，即可脱离层析柱上的载体只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来,达到千倍以上的

19、纯化,并保持较高的活性如果目的蛋白作为药品，处理后的产品中存在微量染料或金属都会对机体造成损害亲和层析技术是基于蛋白质可与另一种称做配体的分子能发生特异的可逆结合基于选择性吸附基于选择性吸附差异的分离方法差异的分离方法疏水层析疏水层析利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合的特性进行分离。在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，其他的杂质蛋白则无此种性质，从而使蛋白质初步分离与离子交换层析应用互补，可以作用于分离离子交换很难或不能分离的物质。该方法具有使蛋白质变性、仅适合部分蛋白质等缺点疏水作用层析多用于大分子蛋白质的分离纯化其他方法其他方法反相高效液相色谱法反相

20、高效液相色谱法一种以疏水作用为基础的色谱分离法具有分辨率高、重复性好、回收率高等优点操作繁琐、难放大、成本高，在工业化生产中的应用受到限制分子印迹分子印迹一种识别聚合物特殊结合位点的技术，是将生物大分子从凝胶转移到固定基质的过程。制备容易，成本低廉，强稳定性模板易流失随着分离蛋白质印迹聚合物的成功合成，蛋白质印迹技术已成为研究热点高效毛细管电泳高效毛细管电泳是 20 世纪 80 年代问世的一种高效液相分离技术，是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的产物。目前，它已成为分析科学中最具活力的方法之一其分离效率高、分析速度快、样品用量少、抗污染能力强和易自动化等特点仪器设备精密，成本高被广泛应用于分子生物学、医学、药学以及高分子等多个领域柱层析柱层析通常采用固定床间歇操作方式柱层析具有很高的分离效率，且操作简单但存在着载体利用率低和过程效率低的问题是