DuchenneBecker肌营养不良症基因缺失的检测及缺失.

1、Duchenne/Becker肌营养不良症基因缺失的检测及缺失类型与临床表型的关系刘玉阁刘辉谢丙【摘要】目的 了解Duchenne/Becker肌营养不良症(DMD/BMD基因缺失的分布及其与表型的关系。方法 采用18对引物多重聚合酶链反应(mPCR分两步对96例DMD/BM进行筛查。结果用第一组引物检出49例缺失，第二组 引物检出11例缺失，分别占全长cDNA探针检出缺失的79呀口 18%两组引物检 出缺失的总和占全部缺失的97% 60例缺失中，DMD4例 (70%),中间型3例 (5%), BMD1例(22%),未分类2例(3%)。43例(72%)缺失分布于外显子 44 52, 17例(2

2、8%)分布于外显子119。结论 基因缺失主要分布于基因3"侧外 显子4452和5"侧外显子1219两个热区。临床表型与基因缺失类型有密切 关系，41例移码缺失破坏了翻译阅读框架而导致基因功能丧失，表型为严重的 DMD 11例整码缺失位于外显子243,基因部分功能保留，表型为较轻的中间 型和BMD【关键词】聚合酶链反应肌营养不良基因缺失Detectio n of Duche nn e/Becker muscular dystrophy (DMD/BMD) gene deleti ons and its associatio n with phe no typeLiu Yuge

3、, Liu Hui, Xie Bi ngdi.Neurological Research In stitute, Gen eral Hospital, Tianjin MedicalUn iversity, Tianjin 300052【Abstract 】 ObjectiveTo an alyse the deleti on distributio nand the relatio n of distributi on of gene deleti ons and phe no type inDuche nn e/Becker muscular dystrophy (DMD/BMD). Me

4、thodsNin ety-sixpatie nts with DMD/BMD were scree ned with the multiplex polymerase cha in reacti on (mPCR) amplificatio n using 18 pairs of primers.ResultsForty-nine deleti ons were detected with the first set and 11with the sec ond set which acco un ted for 79% and 18% of those detected by full le

5、 ngth cDNA probes respectively. These two multiplex reactio ns detected about 97% of deleti ons in DMD/BMD patie nts. In 60 deletio ns, 42 were of DMD (70%), 3 in termediate (5%), 13 BMD (22%), and 2 cases (3%) were not classified. Forty-three deleti ons (72%) were located in exo ns 4452 and 17 (28%

6、) in exons 119. Co nclusio nsThe gene deleti ons were main ly distributed in the 3" term inus of the gene cen tral regi on around exons 4452 and 5" term inus of the genearound exons 12 19. The phe no type was associated with the type ofgene deletion in DMD/BMD. The phenotype of 41 frameshi

7、ft deletions was severe DMD, which disrupted the reading frame, resulting in the loss of the gene function. The phenotype of 11 in -frame deletions distributed in exons 243 with partial gene fun cti ons wasintermediate patient and BMD.【Key words 】 Polymerase chain reactionMuscular dystrophyGene dele

8、tionDuchenne/Becker肌营养不良症(DMD/BMD是一种常见的X连锁隐性遗传性 疾病，二者是等位基因疾病，发病率分别为新生男婴的 1/3 500 和1/30 000 。 1/3由新生突变引起1。近年对DMD/BM的研究取得了新的进展，致病基因 已定位于Xp21,基因长2 300kb，含70个外显子，编码一种位于肌细胞膜上的 骨架蛋白 -" 肌营养不良蛋白 "(dystrophin) ，基因缺失或重复均导致进行性肌营 养不良症 2， 3。 Chamberlain 等4采用 9对引物多重聚合酶链反应 (mPCR检出DMD/BM基因缺失的80% Beggs等5设计

9、了另外9对引物并联 合应用这两组引物检出基因缺失的 98%，从而对本病基因检测建立了一种简便 快速的诊断方法。本组参照上述引物序列合成 18对引物，对我院经临床，肌电 图，血清酶学和肌活检确诊的 96例无亲缘关系的DMD/BM进行基因缺失筛查， 并对我国DMD/BM基因缺失的分布及其与临床表型的关系进行初步探讨。对象和方法一、对象96例患者均为我院 19921996年住院或门诊患者，均为男性，发病年龄 618岁(平均 12.4±3.3 岁)，根据丧失行走能力的年龄将患者分为 4型： Duchenne型(DMD)65例(68%)，813岁以前丧失行走能力；(2)中间型6例 (6%)，1

10、316岁丧失行走能力；(3)Becker型(BMD)20例(21%)，16岁后仍能行 走； (4)5 例(5%)8 岁以下患者未能分型。临床均表现为四肢近端对称性进行性 加重的肌肉萎缩，70%伴有腓肠肌或二头肌假肥大，均有 Gower征阳性。肌电图 检查显示典型肌源性改变，血清肌酸磷酸激酶 (CK)及其同功酶MCK匀显著增 高，肌活检显示镶嵌分布的肌纤维萎缩，肥大，玻璃样变和坏死等典型病理改 变。 30例正常对照均为非神经肌病患者。二、测定方法1. DNA的提取：抽取患者和正常对照外周血 5 ml，加入0.2%依地酸，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用等渗溶血法裂解红细胞后离心分离白细胞，加入

11、1%十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K，37C消化46小时，再加入1/3体积的饱 和氯化钠，离心除去沉淀，用等体积的氯仿抽提两次， 2.5 倍体积的无水乙醇 沉淀， 75%乙醇漂洗，晾干后溶于 TE(10 mmol/L Tris.CI, 1 mmol/L EDTA ， pH 7.6)，-20C保存。2. mPCR 18对引物参照Chamberlain和Beggs等4, 5提供的序列由美国CyberSyn公司合成，经寡核苷酸纯化柱(OPC纯化。将18对引物分为两组 (第1 组：外显子 4， 8， 12， 17， 19， 44， 45， 48， 51；第 2组：启动子，外 显子3，6，13，43，

12、47，50，52，60)，分两步对全组患者进行 mPC扩增。50 M l PCR 反应体系含 670 mmol Tris-HCI(pH 8.0)，166mmol(NH4)2SO, 67 mmol MgCI2, 10 mmol B -巯基乙醇，10 Mg/ Ml 小牛血清白蛋白(BSA), 25 mmol dNTP每对引物各0.25 Mmol，模板DNA 500 ng。将反应液97C予变性 10分钟，加入5UTaqDN聚合酶(德国BM产品)，混匀后加入35 Ml石蜡油。 按照94C变性30秒，56C复性30秒，70C延伸2分钟进行30次循环，最后 70C延伸7分钟。取10 M l扩增产物用2%琼

13、脂糖或6%聚丙烯酰胺凝胶在0.5 XTBE中电泳，溴化已锭染色，在紫外灯下观察结果并摄影，或用0.2%硝酸银染色保留结果。结果96例患者用18对引物mPC扩增共检出60例缺失，其中用第1组引物检 出 49例缺失，检出率为 51%，用第 2组引物在未检出缺失的 47例中检出 11 例 缺失，检出率为 12%(图 1， 2)。两组引物检出的总缺失率为 63%。 60例缺失中 DMD4例(70%)，中间型 3 例(5%)，BMD13例(22%)，未分类 2 例(3%); 41 例为 移码缺失，19例为整码缺失。全部缺失均经全长 cDNA探针(1-2，2b-3,4- 5a,5b-7，8，9-14)(质

14、粒由Kunkel教授赠送)Southern杂交证实，用18对引 物检出的缺失占全长cDNA探针检出缺失的97%因两组引物均未覆盖基因中心 区，用cDNA探针4-5a和5b-7在这一区域内检出的两例缺失漏检，漏检率为 3%本组用外显子60未检出缺失，可能与病例数较少有关。两步mPC脸出基因3"侧外显子4452缺失43例，占全部缺失的72% 5"侧外显子119缺失 17例，占 28%。 30例正常对照均未见基因缺失。1:扩增带大小标志(PBR322Hinfl) ; 2:正常对照；37: DMD/BM基因内缺失 图1第1组引物mPC扩增DNA分析1:正常对照；27: DMD/BM

15、不同基因内缺失图2 第2组引物mPC扩增DNA分析讨论一、应用mPC技术mPC技术的应用对于DNA分析是一种革命性的探索。以往 DMD/BM基因缺 失需要使用七个不同的亚克隆 cDNA探针检测，基因组DNA至少需用两种不同的 限制性内切酶消化，检测步骤极其繁琐。应用mPC技术大大检化了 Southern印迹分析，根据大部分缺失集中在两个区域的理论，仅检测 70个外显子中的一 部分即可检测出大部分缺失。 Chamberlain 等4首先在基因 3"侧和 5"侧以 9 个缺失热点外显子 （4，8，12，17，19，44，45，48，51） 的旁侧序列设计了 9 对引物，一次mP

16、C扩增即可检出用全长cDNA探针检出缺失的80%二、应用引物扩增Beggs等5在mPC研究的基础上选择另外8个缺失热点外显子（3 , 6, 13， 43， 47， 50， 52， 60）和启动子设计了相应的 9 对引物，进一步扩大了缺失 的检测范围，使本病基因缺失检出率达到 98%以上。上述两组引物联合应用不 仅能扩增外显子4452缺失热区内的大部分外显子，而且还能检测 5"端和基 因远端的缺失，并可分析突变对翻译阅读框架的影响。三、与 Southern 印迹分析比较本组应用18对引物对96例DMD/BM进行两步mPC扩增结果与Southern 印迹分析的结果一致。第1组引物检出49

17、例缺失，占全长cDNA探针检出缺失 的79%第2组引物检出11例缺失，占全长cDNA探针检出缺失的18%两组引 物检出缺失的总和占 Southern 印迹分析检出缺失的 97%。这一结果与国外文献 报道的缺失检出率接近5, 6。实践证明这两组引物也适用于中国人 DMD勺 基因诊断。应该指出的是，应用 mPC可以避免Southern杂交在基因诊断中的 某些失误，例如两例应用CDNA8探针杂交显示缺失外显子4852,但是用mPCR 扩增时外显子 51 和 52 扩增带均显示清晰。 Southern 杂交出现失误的原因可能 是由于DNA印迹转移不良，或在膜杂交的过程中出现气泡阻碍杂交过程。由于 两套

18、引物均未覆盖基因中心区，本组两例相当cDNA探针4-5a和5b-7检测区域内外显子2040和2142缺失漏检，漏检率仅为3%但由于mPC快速，准 确，基因组DNA用量少，采用两套引物即可覆盖基因 3"和5"侧大部分缺失热区 外显子和基因的远侧端，其优越性已大大超过Southern印迹分析。mPC对反应条件要求较高，使用国产 Taq酶有时出现假阳性。改用BM德国）Taq酶，在 缓冲液中加入 0.01%明胶，并将循环次数增加至 3035次，可稳获 9条扩增 带。还应避免基因组DNA保存时间过长，以免DNA发生降解而出现假阳性。四、DMD/BM基因缺失分布规律本组资料分析显示，D

19、MD/BM基因缺失的分布确有一定的规律。60例缺失 中43例（72%）分布于外显子4452,相当于cDNA探针8和7的3"侧4个外显 子覆盖的区域内。基因缺失范围的大小不尽相同，其中以外显子 48， 50， 51 和 52受累最多见。 17例（28%）缺失分布于 5"侧外显子 119，其中以外显子 12 19受累最多见，19次之。这种缺失分布不均一的现象表明 DMD/BM的缺失热 区主要分布在基因中心区 3"侧外显子 4452或 4852，另一个缺失热区分布 在基因 5"侧外显子 1219。 Koenig 等7通过对 329例 DMD/BMD South

20、ern 印迹分析，发现其中 75%的基因缺失分布在基因中心区 3"侧， 25%分布在基因 5"侧，并将这两个区域称为缺失热区。这一基因缺失分布规律相继被以后的研 究所证实5, 6, 8。由此可见，我国DMD/BM基因缺失的分布规律与欧洲白 种人基本相似。五、DMD/BM的临床表型与基因缺失类型的关系近年研究证实，DMD/BM的临床表型与基因缺失类型有密切的关系7。 本组 41 例患者为移码缺失，因缺失破坏了翻译阅读框架而导致基因功能丧失， 临床表型为严重的DMD常于913岁丧失行走能力。19例为整码缺失，其中 11 例缺失位于外显子 243，因缺失部位不是基因的关键部位，部

21、分基因功能 得以保留，临床表型为症状较轻的中间型和BMD分别于1316岁和16岁以后丧失行走能力； 8例缺失位于基因中心区 3"侧，缺失均累及外显子 51，其中6例(75%)表现为严重的DMD仅两例(25%)为轻型BMD Koenig等9发现51 号外显子恰与肌细胞膜骨架蛋白 dystrophin 绞链 3 相对应，绞链 3 对维持 dystrophin 的弹性和柔韧性起着重要作用。故累及基因中心区 3" 侧外显子 51 的整码缺失临床多为严重的 DMD表型。作者单位： 300052 天津医科大学总医院神经病学研究所参考文献1 Koenig M, Hoffman EP, B

22、ertelson CJ, et al. Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy cDNA. Cell, 1987, 50:509-517.2 Monaco AP, Bertelson CJ, Liechti-Callati S, et al. Anexplanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics 1988, 2:90-95.3 Burmeister M, M

23、onaco AP, Gillard EF, et al. A 10-megabase physical map of human Xp21, including the Duchenne muscular dystrophy gene. Genomics, 1988, 2:189-202.4 Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier HE, et al. Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy. New York: Acade Press,1990. 272-281.5 Beggs AH, Koenig M, Frederick M,