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文档简介
1、2肿瘤标志物定义:观念上肿瘤标志物是从病人血液,尿液或其他样本中找到的某一肿瘤 的生化分析物。例如,肝癌的癌胚抗原。另外,它们的相关性将通过 肿瘤标志物定量,在特定标准值以上来说明肿瘤的存在。 最后,肿瘤 标志物的数量会提示有多少种肿瘤存在或肿瘤的发展处于哪个阶段, 并不是所有的标志物都满足定义的标准。肿瘤标志物的临床限制:不幸的是,大多数肿瘤标志物对某个已知肿瘤既没有特异性也 不能通过定量来判断它们的大小。大多数肿瘤标志物都存在这样的限 制性。每种肿瘤的特异性和敏感性能够作为肿瘤的筛选或其定量的指 标,需长期评估直至肿瘤标志物的临床和分析的结果出现显著的统计 学意义。当病人被怀疑患有癌症时,
2、医生会要求做肿瘤标志物的定量,在 大多数病人中,癌胚抗原有一个正常范围,大约0-10ug/L,但它不是 一个很好的筛选指标,因为在其他情况下,如抽烟,酒精性肝硬化, 肠炎或慢性肺部疾病时,它也可能高于 10ug/L。因此,尽管15ug/L 高于那些不抽烟的正常人的参考区间,但这样的值反应的是病人潜在 的慢性肝病,肠部疾病或肺部疾病,而不是肿瘤的存在。这种限制性 使得癌胚抗原不能通过定量来筛选胃肠道肿瘤。 一个确诊的肿瘤患者 的癌胚抗原的显著升高能被临床检测出来。如果肿瘤因治疗而好转, 癌胚抗原水平通常会下降,如果升高这就是试验性的证据,说明肿瘤 持续恶化,而病人会被认为预后不良。肿瘤标志物的实
3、验室检测:尽管肿瘤标志物可能被定性的检出它们是否存在, 但它们更多地进行 定量检测和与正常参考值做对比来考虑是否升高。生化技术用于检测 这些分析物的变化,这些技术包括从传统的酶学检验,免疫分析到细 胞遗传学技术。标志物的生化种类和浓度范围通常决定检测的方法与 要求,现在免疫学方法是盛行的定量检测肿瘤标志物的方法。从历史上看,放免技术是第一种普遍用于检测这些分析物的方法。这种方法用放射活性作为一种性能来定量抗原抗体反应。最近,通过商业化的发展使得各种方法避免了放免技术所存在的弊端。例如,检测放射性 物质,文献的要求和试剂盒短的有效期。新的方法是利用分光光度酶 率检测,荧光物质,极化荧光素,时间分
4、辨荧光和化学发光去定量抗原 抗体。以下是这个章节中大多数肿瘤标志物的定量方法。3聚合酶链反应(PCR)PCR技术是研究得最深入,运用得最广泛的靶技术,X公司的科学家在1985年第一次介绍了什么是PCR,之后PCR发展成为了分子生 物学实验室的一项主要的技术,这个方法是利用寡核甘酸指导DNA合成的重复循环,来实现目的序列的体外复制。寡核甘酸的序列是由 目的基因来决定的,这些寡核甘酸是在具有两条不同链的靶序列的互 补位点上开始合成的。它们之间大约相隔 150-3000个碱基对。PCR的每个循环包括3个步骤:1变性,在缓冲体系中,靶基因在高 温下孵化以致于靶链解离。同时加入特定的寡核甘酸引物。 2退
5、火,在这个混合反应体系中,需降温才能使互补的靶序列间发生退火结合。3延伸,延伸阶段通常需在温和的温度下进行。引物在 DNA聚 合酶的作用下,于DNA模板上延伸。每一次循环靶序列在理论上会 增加一倍(但实际上最后的几次循环没有这么高的效率)。重复了多 次以后(约20-60次),靶序列可扩增100万倍,特定的靶序列扩增 产物能通过它特定的长度和内部结构来识别。 而非特异性扩增产物很 少具有与特定靶序列产物一样的大小,并且这些非特异性产物也不含 有与特定靶序列的杂交结构。在传统的杂交方面,由不完整的碱基组成的引物,可通过非特异性的 方法进行退火反应,他能够结合在靶基因的多个位点上,或者纯化基 因组D
6、NA,因此,对于低丰度的靶基因,非特异性结合的背景,或 许比特异性的还要敏感。然而 PCR反应,需要通过两个特异性引物 反应来解决这个问题。这两个引物,在对应链的相对方向的退火位点 上开始合成。为了能更有效地进行聚合酶链反应,要求第二个引物的 退火位点能与第一个退火位点有一个适当的距离。 产物的等倍性增加 依赖于新引物位点上引物的直接合成。通过这种设计能够更好地提高 PCR的敏感性和特异性。最近技术的更新不仅简化了 PCR的操作步骤,同时也提高了它的效 率。首先,使用的taq聚合酶是从70-75.C温泉里生长的嗜温菌和嗜 热水生菌体内分离出来的。这些taq聚合酶的半衰期在95.C是40分 钟,
7、因此它能耐受PCR中的重复加热和冷却。这样,它可以不用重 复加入新的酶来补充在先前步骤中失活的酶,taq聚合酶在反应开始时就加入进去,这样能有效地简化操作步骤。止匕外,通过这种方式也 能显著地减少在退火和延伸阶段因为高温而引起的非特异性扩增。()第二个新方法是程序化加热器的发展,热循环器其实是一种可编程的 加热器,它能够在没有人看管的情况下实现连续的加热和冷却循环, 并且能消除水浴锅与加热器的反应管之间的转换这种令人厌烦的工 作。热循环器现已被许多厂家生产和它已成为了实验室标准配置仪 器。5高脂血症血中主要的酯质是甘油三酯和胆固醇,前者是一种重要的能量来源, 后者是细胞膜和细胞器的组成成分。胆
8、固醇和甘油三酯是脂溶性的, 他们在血液当中以脂蛋白形式运输,酯质和特定的蛋白结合成众所周 知的载脂蛋白。脂蛋白主要分成四种,1乳糜微粒,把肠内外源性酯 质(主要是甘油三酯)运输到外周组织。2极低密度脂蛋白,它运输 内源性甘油三酯,从肝组织到其他组织。3低密度脂蛋白,它主要是 把肝内的甘油三酯运输到外周组织。4高密度脂蛋白,它参与内向转 运胆固醇,从外周组织到肝,以致于胆固醇能够通过这种途径被排泄。 这些颗粒处于一种活跃的状态,酯质和蛋白之间很大一部分能够相互 转换。1、 革兰染色革兰染色是细菌学上使用最广泛的着色方法,同时大部分生物体是 根据对它的反应来分类的。革兰氏阳性的生物体必须拥有完整的
9、细胞壁, 相似的生物体会因任何的方法损害了细胞壁而呈革兰氏阴性,这表明了细胞壁保留的染料 的重要性,染色的原理如下。碱性染料扩散到生物体后与碘形成不溶于水的色淀, 革兰氏阳性生 物体的媒染细胞壁经酒精脱色或丙酮脱水形成一个染料色淀不能通 过的屏障,在革兰氏阴性细胞中,细胞壁上的脂类(按比例多于革兰 氏阳性细胞)可能被溶解,从而允许结晶紫-碘复合物漏出。对这个 学说虽然有很多的反对者,但细胞壁的重要性是不可否认的。过程:1、 准备和固定已标记的标本2、 用结晶紫染色一分钟,然后用碘洗去3、 添加更多碘媒染1min4、 用酒精脱色直到流出的酒精不再出现蓝色为止5、 用水冲洗6、 在稀释石炭酸复红中复染1min7、 用清水冲洗并干燥很多实验室使用替代方法来区分或复染色,其中有一些是:丙酮:丙酮或一份丙酮和2份乙醇是比70%的乙醇更快速的脱色剂,快速 脱色不利于检测细菌量少的标本,也不利于无经验的技术人员使用。 中性红色:中性红色(中性红色1g, 1%乙酸2ml和蒸储水1000ml)可能被用 作复染色。对于染色细胞内的生物体,它是有用的,而且
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