流式细胞术讲义ppt课件

1、北京协和医院血液科北京协和医院血液科汪汪 玄玄l 流式细胞术流式细胞术Flow cytometry；FCM是集计算是集计算机技术、激光技术、电子技术、流膂力学、细胞化机技术、激光技术、电子技术、流膂力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术与方法为一体的现学、细胞免疫学等多门高新技术与方法为一体的现代细胞分析技术，它以流式细胞仪代细胞分析技术，它以流式细胞仪Flow cytometer为工具，在单细胞程度上对大量细胞为工具，在单细胞程度上对大量细胞进展高速每秒计数可达进展高速每秒计数可达100010000个细胞、准个细胞、准确、多参数的定量分析或分选纯度可达确、多参数的定量分析或分选纯度可达99

2、%以以上，已成为现代骨髓血细胞学研讨中最先进的分上，已成为现代骨髓血细胞学研讨中最先进的分析技术。析技术。l 阵发性睡眠性血红蛋白尿症阵发性睡眠性血红蛋白尿症PNH是是一种获得性基因突变所致的克隆性疾病，一种获得性基因突变所致的克隆性疾病，其异常的血细胞膜糖化肌醇磷脂锚其异常的血细胞膜糖化肌醇磷脂锚GPIanchor衔接蛋白如衔接蛋白如CD59,CD55等表达明显减低或缺乏，导致对补体的敏等表达明显减低或缺乏，导致对补体的敏感性加强而产生溶血性贫血。感性加强而产生溶血性贫血。vEDTA抗凝血或骨髓抗凝血或骨髓3mlv每天上午送检每天上午送检v收费：收费：CD55/CD59 280元元v CD5

3、9 140元元vCD59阳性的红细胞大于等于阳性的红细胞大于等于95%vCD59阳性的中性粒细胞大于阳性的中性粒细胞大于90%l 流式细胞术流式细胞术FCM白血病免疫分型是利用荧光白血病免疫分型是利用荧光染料标志的单克隆抗体染料标志的单克隆抗体McAb检测相应抗原，经检测相应抗原，经过多参数分析，测定白血病细胞的细胞膜、细胞浆过多参数分析，测定白血病细胞的细胞膜、细胞浆和细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所和细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。属细胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表分析白血病免疫表型时丈量细胞数量普通是在型时丈量细胞数量普通是在100

4、0050000个细胞之间，个细胞之间，而且快速、特异、准确、反复性好，能区分细胞的而且快速、特异、准确、反复性好，能区分细胞的系列，划分其分化、发育阶段等，对白血病的诊断系列，划分其分化、发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判别、发病机制研讨与分型、治疗方案选择与预后判别、发病机制研讨等有重要价值。等有重要价值。肝素抗凝骨髓肝素抗凝骨髓3ml(或外周血或外周血)每天上午送检每天上午送检收费：收费： 70元元/每个单抗每个单抗(临床常规检测临床常规检测12个个单抗单抗)v干干/祖细胞标志：祖细胞标志：v CD34、CA133v髓系标志：髓系标志：v CD33、CD13、CD11b

5、、CD15、MPOvB细胞相关标志：细胞相关标志： v CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、 v CyIg、SmIgvT细胞相关标志：细胞相关标志：v CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8管号管号三色标记三色标记McAb染色细胞及目的染色细胞及目的1MouseIgG1/ MouseIgG1/CD45 PerCP阴性对照及设门阴性对照及设门2CD5 FITC/CD7 PE/ CD45 PerCPT淋巴系细胞、部分早期髓系细胞淋巴系细胞、部分早期髓系细胞3CD10 FITC/CD19 PE/ CD45 PerCPB淋巴系细胞淋巴系细胞4Anti-HLA-DA F

6、ITC / CD13 PE/ CD45 PerCP髓系细胞、髓系细胞、 B淋巴系细胞、部分淋巴系细胞、部分T淋淋巴系细胞巴系细胞5CD34 FITC/CD38 PE/ CD45 PerCP反映细胞分化程度反映细胞分化程度6CD14 FITC/CD33 PE/ CD45 PerCP髓系细胞和单核细胞髓系细胞和单核细胞7CD20 FITC/CD22 PE/ CD45 PerCPB淋巴系细胞及其分化程度淋巴系细胞及其分化程度8CD8 FITC/CD4 PE/ CD45 PerCPT淋巴系细胞及其分化程度淋巴系细胞及其分化程度9CD3 FITC/CD16+56 PE/ CD45 PerCPT淋巴系细胞

7、、淋巴系细胞、NK细胞细胞10CD36 FITC/GP-A PE/ CD45 PerCP幼红细胞幼红细胞11CD61 FITC/CD41 PE/ CD45 PerCP巨核细胞巨核细胞B-ALLT-ALLAMLCD10+CD19+CD22c/m+CD3c/m+CD5+CD7+CD13+CD33+MPO+FAB/ CD34CD33HLA-DR CD13CD14CD15CD11b其它其它M1M2M3CD38CD9M4M5M6CD71GP-AM7CD41CD61CD2 CD3 CD5CD7CD4CD8TdT早期早期T-ALL+前前TALL+T-ALL+HLA-DRCD19CD10CD20CD22cIg

8、MmIgMTdT早早B前体前体ALL+普通型普通型+前前B-ALL+B-ALL+l流式细胞术测定发现的双系列或多系列表达的结果较多，流式细胞术测定发现的双系列或多系列表达的结果较多，但双表型白血病不一定就是混合型，理由如下：但双表型白血病不一定就是混合型，理由如下：l混合型白血病诊断：应根据形状、免疫、遗传、分子生物混合型白血病诊断：应根据形状、免疫、遗传、分子生物学等综合判别，属双系列双克隆？双表型单克隆？学等综合判别，属双系列双克隆？双表型单克隆？系列转换型？系列转换型？l需思索到抗原需思索到抗原/单抗的多向性：单抗的多向性：lCD4、CD7、CD10、CD38、CD56l正常血细胞随分化

9、成熟，各系列血细胞的免疫标志特性逐正常血细胞随分化成熟，各系列血细胞的免疫标志特性逐渐规律化：渐规律化：l白血病细胞的分化发育却丧失严厉的规律性白血病细胞的分化发育却丧失严厉的规律性lineage infidelity与免疫表型的阶段性与免疫表型的阶段性differentiation asynchrony，因此出现异常抗原表达，或过高或过低或，因此出现异常抗原表达，或过高或过低或不表达或交叉系列表达。不表达或交叉系列表达。u采用采用CD45/SSC设门法设门法优于优于FSC/SSC设门法设门法uCD45其表达程度在不其表达程度在不同细胞各异。淋巴细胞同细胞各异。淋巴细胞单核细胞单核细胞成熟粒细

10、胞成熟粒细胞原原/幼细胞，而红细胞幼细胞，而红细胞不表达。不表达。uSSC在成熟粒细胞在成熟粒细胞单单核细胞核细胞原原/幼细胞幼细胞淋淋巴细胞巴细胞红细胞。红细胞。按照新的按照新的WHO分型规范，对初发病者，分型规范，对初发病者，原原/幼细胞占总细胞数幼细胞占总细胞数20%以上即可判为以上即可判为白血病。白血病。对于临床原对于临床原/幼细胞群定量应以原幼细胞群定量应以原/幼细胞幼细胞群的细胞数为分母。群的细胞数为分母。对于临床原对于临床原/幼细胞群定性比定量更重要。幼细胞群定性比定量更重要。l病例病例1l梁丽琴梁丽琴 女性女性 24岁岁l异常表型中异常表型中:lCD10+. CD34+.lCD

11、22+. CD38+.lCD19+. HLA-DR+l结论：表型符合结论：表型符合Pre-B-ALLl病例病例2l王丙午王丙午 男性男性 68岁岁l异常表型中异常表型中:lCD33+. CD13+.lCD15+.CD11b+. lHLA-DR+.lCD34+.CD19+l结论：表型符合结论：表型符合AML-M2l病例病例3l冯亮冯亮 男性男性 33岁岁l异常表型中异常表型中:lCD34+. CD10+. lCD22+. CD19+. CD33+. CD13+.lCD15+. HLA-DR+l结论：表型符合双结论：表型符合双表型白血病表型白血病 造血干造血干/祖细胞存在于骨髓和外周血中，祖细胞存在于骨髓和外周血中，形状与淋巴细胞类似，用普通形状学方法形状与淋巴细胞类似，用普通形状学方法难于识别。但根据造血干难于识别。但根据造血干/祖细胞的特征，祖细胞的特征，可用可用FCM多参数分析血液、骨髓和浓缩白多参数分析血液、骨髓和浓缩白细胞悬液中造血干细胞悬液中造血干/祖细胞的数量，对血液