动物细胞高纯内质网分离试剂盒产品说明书中文版VIP

1、动物细胞高纯内质网分离试剂盒产品说明书(中文版)要紧用途动物细胞高纯内质网分离试剂是一种旨在通过机械或化学处置、差速和等密度离心方式，从动物细胞中分 离出活性完整而高度纯化的内质网细胞器组分的权威而经典的技术方式。该技术通过精心研制、成功实验 证明的c其制备物产量高，活性保证，纯度可达99%。适合于各类动物原代和培育细胞(人体、老鼠、兔 子等)内质网的制备c能够被用于细胞色素P450系统外源化合物(xenobiotics)代谢、脂类代谢、内质 网膜蛋白和腔内蛋白等研究。产品不含污染性蛋白酶和核防，即到即用，性能稳固，分离产量高。技术背景内质网(endoplasmic reticulum： ER

2、)是真核生物的细胞器组分，组成细胞内小管(tubules)、囊泡(vesicles)和小池(cisternae/sac)彼此连接的网络结构，负责蛋白转译、折段和转运成为细胞膜成份 (例如跨膜受体和其它整合膜蛋白等)或分泌型蛋白(例如消化性的)，负货钙离子区隔(sequestration).和糖原、固醇类和其它大分子的生产和贮存等功能。内质网分成三种：粗面内质网(Rough endoplasmic reticulum： RER)、滑面内质网(Smooth endoplasmic reticulum： SER)和肌质网(sarcoplasmic reticulum： SR) o依照细胞代谢的需要，

3、粗面内质网和滑面内质网会相互转换c粗面内质网通过核糖体合成蛋白质并 分类：滑面内质网进行固醇、碳水化合物和药物代谢等。肌质网的要紧功能为贮存和择放钙离子。内质网 的分离是现代细胞生物学研究的经常使用手腕之一：第一，通过机械或化学方式破裂组织细胞：第二，通 太低速差速离心去除残渣碎屑和庞大细胞器：第三，通太高速差速离心取得内质网：乃至，第四，能够通 过等密度离心取得纯度更高的内质网。产品内容清理液(ReagentA)充升裂解液(ReagentB)军升净化液(ReagentC)电升活性液(ReagentD)微升强化液(ReagentE)充升保留液（Reagent亳升高纯液(Reagent G)亳升

4、分层液(Reagent H)充升产品说明书1份保留方式保留净化液(Reagent C)和活性液(Reagent D)在一20c冰箱里，其余的保留在4c冰箱里，有效保证6月用户自备HANK平稳盐缓冲溶液(HL12028)或PBS缓冲溶液(HL12033)：用于清理细胞胰蛋白防乙二胺四乙酸混合液(HL12024)：用于细胞离开完全细胞培育液(HL12052)：用于细胞处置所需的培育基50空开锥形离心管：用于样品制备的容器15皂升锥形离心管：用于样品制备的容器在开离心管：用于样品操作的容器6军升超速离心管：用于超高速离心的容器4c台式离心机：用于样品制备4c超速离心机：用于样品制备D0CNCE匀浆器

5、：用于裂解组织试管固定支架：用于离心管固定支撑3号针筒和18号针头：用于搜集样品实验步骤一、组织匀浆法实验开始前,将试剂盒里的净化液(Reagent C)和活性液(Reagent D)冻融，然后移出移取x工微升活 性液(Reagent D)、讣皂升 净化液(Reagent C)到xx邕升的 裂解液(Reagent B)里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液然后进行以下操作,1 .预备5至10瓶75cm，细胞培育瓶的细胞(5 X 10：),直至细胞生长铺满整个培育表面2 .别离加入10充升用户自备的HANK平稳盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每一个细胞培育瓶，粗盖培育瓶表而，然后抽去3 .重匏实验

6、步骤2一次4 .加入3亮升用户自备的胰蛋白酣乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面5 .置入37c培育箱3分种6 .轻轻手击震动培育瓶，使细胞脱落，7,别离加入10亳升用户自备的完全细胞培育液8 .移入一个50克升锥形离心管9 .放进台式离心机离心10分钟，速度为200g10 .警惕抽去上清液11 .加入xx亳升预冷的 清理液(Reagent A),混匀细胞12 .放进台式离心机离心】0分钟，速度为300g13 .警惕抽去上清液14 .加入xx空升侦冷的裂解工作液15 .涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群16 .即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器17 .在冰槽里用匀浆帮匀化细胞(约20至40下)

7、(注意：参见注意事项7)18 .将所有细胞匀浆物移入15亳升锥形离心管19,放进4c台式离心机离心10分钟,速度为1000g20 .警惕移出上清液到另一个新的预冷的15亳升锥形离心管一一21 .放进4c超速离心机离心15分钟,速度为12000g22 .警惕移出上清液到预冷的6在升超速离心管23 .放进4c超速离心机再次离心60分钟，速度为100000g24 .警惕抽去上清液，保留沉淀颗粒一一25 .即刻加入xx微升 保留液(Reagent F),充分混匀沉淀物26 .置于冰槽里备用27 .预备1个6吆升超速离心管28.加入xx是升 高纯液(Reagent G)29 .警惕沿着管壁,在 高纯液(

8、Reagent G)上面,一滴一滴加入xx亳升 分层液(Reagent H)(注意: 幸免晃动)30 .警惕沿着管壁，在 分层液(Reagent H)上面，一滴一滴加入工工微升上述内质网组分(注意：幸免晃 动)31 .警惕放进4c超速离心机再次离心30分钟,速度为130000g32 .警惕掏出超速圈心管：可见上端三分之一处(滑向内质网)和下端三分之一处(粗面内质网)棕色或 乳黄色样品带33 .警惕抽去滑而内质网样品带以上的液体34 .警惕搜集滑面内质网样品带到2军升离心管(注意：用3忘升针筒和1S号针头,且于样品带下缘警惕 缓慢抽吸)35 .进一步抽去粗面内质网样品带以上的液体36 .警惕搜集

9、粗面内质网样品带到另一个2空升离心管(注意：用S空开针筒和18号针头,置于样品带下 缘警惕缓褪抽吸)一一37 .别离加入xx至xx皂升 保留液(Reagent F)38 .放进4c超速离心机离心10分钟,速度为100000g39 .警惕抽去上清液40 .别离加入xx微升保留液(Roagont F)，混匀41 .放进一70c冰箱里保留二、化学处置法实验开始前，将试剂盒里的净化液(Reagent C)和活性液(Reagent D)冻融,然后移出移取x工微升活 性液(Reagent D)、xx充升 净化液(Reagent C)到xx戛升的 裂解液(Reagent B)里，混匀后，置入 冰槽里，标记为

10、裂解工作液 然后进行以下操作。1 .预备5至10瓶75cm'细胞培育瓶的细胞(5 X 10：),直至细胞生长铺满整个培育表面2 .别离加入10电升用户自备的HANK平稳盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每一个细胞培育瓶，粗盖培育瓶 表面，然后抽去3 .重苴实验步骤2一次4 .加入3亮升用户自备的胰蛋白醐乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面5 .置入37c培育箱3分种6 .轻轻手击震动培育瓶，使细胞脱落7,别离加入10亳升用户自备的完全细胞培育液8 .移入一个50亳升椎形离心管9 .放进台式离心机离心10分钟，速度为200g10 .警惕抽去上清液11 .加入xx老升攸冷的 清理液(Reag

11、ent A)12 .放进台式离心机离心10分钟，速度为300g13 .警惕抽去上清液14 .加入xx玄升位冷的裂解工作液15 .涡旋震荡5秒，充分混匀16 .在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次17 .加入xx微升侦冷的 强化液(Reagent D)18 .涡旋震荡5秒，充分混匀19 .在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次(注意：参见注意事项8)20 .加入xx空升侦冷的裂解液(Reagent B)，轻轻摇动试管混匀21 .放进4X;台式离心机离心10分钟,速度为1000g22 .警惕移出上清液到另一个新的预冷的15玄升锥形离心管一一23 .放进4c超速离心机离心20分钟,速度为120

12、00g24 .警惕移出上清液到预冷的6忘升超速离心管25 .放进4c超速离心机再次离心60分钟，速度为100000g26 .警惕抽去上清液，保留沉淀颗粒一一27 .即刻加入xx微升 保留液(Reagent F),充分混匀沉淀物28 .置于冰槽里备用29 .预备1个6亮升超速离心管30 .加入xx老升 高纯液(Reagent G)31 .警惕沿着管壁，在 高纯液(Reagent G)上面，一滴一滴加入乂工电升 分层液(Reagent H)(注意： 幸免晃动)32 .警惕沿着管壁，在分层液(Reagent H)上面，一滴一滴加入工工微升上述内质网组分(注意：幸免晃 动)33 .警惕放进4c超速离心

13、机再次离心30分钟，速度为130000g34 .警惕掏出超速离心管：可见上端三分之一处（滑向内质网）和下端三分之一处（粗面内质网）棕色或 乳黄色样品带35 .警惕抽去滑而内质网样品带以上的液体36 .警惕搜集滑面内质网样品带到2军升离心管（注意：用3忘升针筒和1S号针头,且于样品带下缘警惕 缓慢抽吸）37 .进一步抽去粗面内质网样品带以上的液体38 .警惕搜集粗面内质网样品带到另一个2电升离心管（注意：用3亳升针筒和1S号针头,置于样品带下 缘警惕缓悔抽吸）一一39 .别离加入xx至xx在升 保留液（Reagent F）40 .放进4c超速离心机离心10分钟,速度为100000g41 .警惕抽

14、去上清液42 .别离加入xx微升保留液（Reagent F），混匀13.放进一70c冰箱里保留注意事项1 .本产品为10次（5 X 10：动物细胞操作2 .操作时，须戴手套3 .操作时，幸免污染母液，尤其是 裂解液（Reagent B）和 保留液（Reagent F）4 .所有操作均须在4或以下状态进行5 .建议利用足够的样品量6 .建议严格操纵操作时刻7 .通常匀化次数为20至40下（或细胞颗粒群消失为止）达到80%的组织细胞裂解为理想状态，但不同 的细胞类型会存在不同。用户能够通过显微镜观看3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮 的阿环。低于50%能够增加匀化次数8 .通常孵育5分钟（不宜超过5分钟）达到80%的组织细胞裂解为理想状态,但不同的细胞类型会存在 不同。用户能够通过显微镜观看3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50% 能够增加孵育时刻和涡旋震荡次数9 .关于难以裂解的细胞，例如HeLa细胞，采纳物理匀浆法是优先推荐的技术处置10 .脑组织的内质网沉淀颗粒超级松动，注意操作损失11 .通常5 X 10：动物细胞的内质网含量为500至1000微克蛋白12 .木产品所取得的内质网纯度达95笑以上13 .内质网的