实时荧光定量PCR法检测人骨肉瘤耐MTX细胞系中RFCDHFRGSTπ的mRNA表达

1、实时荧光定量PCR&检测人骨肉瘤耐 MTXffl 胞系中 RFC DHFR GST-兀的mRNAg达【摘要】目的研究 RFC处原叶酸载体）、GST-兀（谷胱甘 肽S转移酶兀）、DHFR（二氢叶酸还原酶） mRNA在人骨肉瘤U2-OS 细胞系及人骨肉瘤耐药细胞系 U2-OS/R1-R3中的表达差异，并探讨其 在人骨肉瘤MTX化疗耐药中的意义。方法采用冲击并逐步增加诱 导药物浓度诱导的方法，诱导人骨肉瘤细胞系 U2-OS并建立耐MTX 细胞系（U2-OS/R1-R3,利用荧光定量PC限术在mRNAk平中测RFC GST-%、DHF喳 U2-OS及（U2-OS/R1-R3中的表达。结果本试

2、验成功建立三株人骨肉瘤耐药细胞系 U2-OS/R1-R3中，荧光定量PCR 结果显示MTX耐药与DHFRmRNAii增力口有关，与 RFCmRNA表达降 低有关，与GST-兀mRNA勺表达增加有关。结论本试验在基因水 平探讨人骨肉瘤细胞 MTXft疗耐药机制，DHFR GST-兀基因表达的 增加及RFC®因表达的降低参与了人骨肉瘤细胞的 MTX耐药，为临床 探索骨肉瘤患者的MTX耐药机制提供了重要的依据，为临床筛选 MTX 化疗不敏感患者提供重要的依据。【关键词】 实时荧光定量PCR甲氨喋吟（MTX 还原叶酸载 体（RFC；二氢叶酸还原酶（DHFR;谷胱甘肽S转移酶（GST-兀）Ab

3、stract: Objective To study the difference inexpression of RFC, GST-兀,DHFRmRNAtween humanosteosarcomaU2-OS cell line and the MTX-resisitant variants U2-OS/R1-R3, and to investigate the significance in MTXresistance for human osteosarcoma. Methods Three resistantMTXiumanosteosarcomacell lines were est

4、ablished by pulse exposure parental cell line(U2-OS) in gradually increased dose of MTX. The expression of RFC, GST-兀，DHFRmRNAvere assayed by real-time fluorescencequantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR). Results Three MTX-resistant variants(U2-OS/R1-R3) were successfully established , the re

5、sults of the FQ-PCR revealed that the MTX resistance was associated with the decreased expression of the RFCmRNAand increased expression of DHFRnRNAand GST-兀 mRNA.Conclusion The author investigated the MTX resistant mechanism of humanosteosarcoma cell line at a gene level. The decreased expression o

6、f RFC mRNA and the increased expression of DHFRmRNAand GST-兀 mRNAparticipate in the MTXresistance in human osteosarcoma cell lines U-2 OS. This provides the evidence for exploring the MTXesistance mechanismin clinical osteosarcoma patients ,and helps to screen the patients whoare insensitive to MTX

7、chemotherapy.Key words: real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR); methotrexate(MTX); reduced folate carrier ( RFC ); dihydrofolate reductase(DHFR);Glutathione-S-Transferases-兀（GST-兀）随着新辅助化疗在骨肉瘤治疗中的应用及发展，骨肉瘤的5年生存率已由以前的10%20屣高到现在的60%70%氨甲喋吟（MTX 作为新辅助化疗的主要药物，具在临床实践中存在原发或继发耐

8、药而 影响疗效的现象。以往研究表明，多种基因及表达产物可能参与其耐 药机制。作者运用实时荧光定量 PCRfe,检测还原叶酸载体（RFC, 二氢叶酸还原酶（DHFR,谷胱甘肽-S-转移酶-兀（GST-兀）在人骨 肉瘤细胞株U2-OS及耐药细胞株U2-OS/R1-R3中基因水平的表达，为 临床预测骨肉瘤的耐药程度，筛选化疗不敏感患者提供参考和依据。1材料与方法1.1 材料 人骨肉瘤细胞株U2-OS （购自中国科学院上海生物细 胞研究所），氨甲喋吟（MTX（浙江海正药业公司）、MTT DMSOsigma 产品），酶标仪（sigma960型）、荧光定量PCRt剂盒（Takara公司）、 RFC GST

9、-兀、DHFR GAPDHI物及TaqmanB针（上海生工生物工程 公司）。1.2 方法与步骤1.2.1 人骨肉瘤U2-OS胞株培养于含10例台牛血清、100 U/ ml青霉素、100 g/ml链霉素的RMPI1640培养基中。细胞置于37C、 5%CO细胞培养箱内培养。待细胞增殖至60%- 70%立合状态时进行传 代。加入0.25%夷蛋白酶2 ml, 37c消化45 min,显微镜下见细 胞收缩、细胞间隙变大，形态变圆后加入完全培养液终止消化，用吸 管反复吹打培养瓶底贴壁细胞成细胞悬液，按1 ： 2比例接种于培养瓶中。1.2.2 采用冲击并逐步增加诱导药物浓度诱导的诱导方法。待 细胞增殖至铺

10、满培养瓶底60%- 70%寸数期时，加入起始浓度为50 ng / ml的MTX作用24 h后用37c的1 XPBSS冲液冲洗2次，加入不 含药物的RPMI1640培养液，每天换液1次，以清除死亡细胞及细胞 碎片，到细胞增殖至正常状态后，重复上述药物冲击过程，每一种药 物浓度冲击3次。MT梏物递增浓度为30 ng/ml、300 ng/ml、1" g/ ml、3 wg/ml。耐药诱导历时7个月，选用300 ng/ml(0.66"mol/L) , 1 wg/ml(2.20 W mol/L) , 3 g / ml(6.60 W mol/L)组细 胞株(分别命名为 U2-O&

11、 R1, U2-OS/ R2,U2-OS/ R3)与原代细胞株 作对比试验。1.2.3 生物学特性观察，倒置显微镜下观察 U2-OS U2-OS/R1,U2-OS/ R2,U2-OS/ R3细胞株的细胞形态1.2.4 生长曲线测定，取对数生长期的U2-OS U2-OS/ R1,U2-OS / R2,U2-OS/ R3细胞株接种于24孔板，每孔细胞数为1X 104个。 每个细胞株间隔24 h取3个复孔用苔盼兰染色，计数其中活细胞的 数量，连续计数7d。按每天细胞计数数量绘制细胞生长曲线。1.2.5 FQ-PCR 法检测mRN俵达：RNA fast 200总RN龈速抽 提试剂盒一步法提取各细胞株总

12、 RNA逆转录t剂采用TaKaRa公司 试剂盒（code:DDR037S,检测模板质量。荧光定量PCR试剂采用TaKaR亦司试剂J盒（code:DDR039S。RFC DHFR GST-% , GAPDHI 物和探针均由上海生工生物工程公司合成，具基因序列见表1。Real-Time PCR 反应体系 20 区 l,含 Premix Ex TaqTM（2 x ）10 区 l , RFC DHFR GST-% , GAPDHk、下游引物各 0.7 “（浓度为 6 mol/L）,Taqman 探针各 0.8 “（浓度为 4 mol/L）,ROX Reference Dyen （50 x ）0.4 区

13、 l,模板（cDNA溶液）2 “（相当于总 RNA 100 ng）,RNase free 去离子水5.4 屋。反应仪器为 ABI PRISM 7 500实 时检测扩增仪。反应条件：预变性，95C 10 s 1个循环；PCR5应， 95 C 5 s 60 C 45 s 40个循环。以SDSa件分析循环次数（Ct值）， mRNA1达以/ Ct 值表示。/Ct=RFCg DHFR或 GST-兀孔 Ct 值-GAPDH 孔Ct值。每份标本各种基因的表达量均用其对应的GAPDHS因的量进行校正。目的基因的拷贝数计算公式：目的基因拷贝数2-/Ct法=（Ct目的基因一Ct内参基因）试验组一（Ct目的基因一C

14、t内参基因）对照组表1 RFC DHFR GST-兀、GAPDtt下游引物及TaqmarB针基因序列RFC±游弓I物5'-CGCCACCTTTCAGATTGCAT-3 20bp 下游弓I 物 5 '-CACGTCCGAGACAATGAAAGT G-322bp 探针序歹U 5 '-(FAM)TCAACACGTTCTTTGCCACCATC(TAMRAbPDHF比游弓I物 5'-TGGTTCGCTAAACTGCATCGT-3 21bp 下游弓I 物 5 '-CAGGAATGGAGAACCAGGTCTTC-23bp 探针序歹U 5 '-(FAM

15、)CCAGAACATGGGCATCGGCAAGAA(TAMRAp-3ST-兀上游引物5 ' -CGGGCAAGGATGACTATGTGA-31bp 下游弓I 物 5 '-GGGCTAGGACCTCATGGATCA-321bp 探 针序歹U5 '-(FAM)TGTCCCAGAACCAGGGAGGCAAGAC(TA25bAGAPDHt 游引物5 ' -TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-32bp 下游弓I 物 5 '-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-321bp 探针序歹U5 '-(FAM)TCATCAGCAATGCCTCCTGC

16、ACCA-(TAM4bp326 统计学分析：各数据均以x- 士 s表示，组间比较采用t检验的方法，以 =0.05为检验水准应用SPSS 11.0软件，对所得数据进行处理。2结果2.1 光镜下U2-OS及U2-OS/R1-R3细胞形态(图14)倒置显微镜下观察：U-2OS U-2OS/R1 U-2OS/R2 U-2OS/R3细胞均为贴壁生长，U-2OS细胞呈梭形，排列规则，体积中等，大小均匀，细胞核较大，胞浆较少（见图1）。U-2OS/R1 U-2OS/R2 U-2OS/R3细胞形状不规则，多为多角形，大小不均匀。胞浆明显增大（见图24）,出现多核仁现象（见图2）。2.2 生长曲线系列1为原代U

17、2-OS胞，系列2、3、4分别为U2-OS/ R1,U2-OS / R2,U2-OS/ R3细胞。以细胞培养时间为横轴，每次细胞计数的平均数为纵轴，绘制 生长曲线。各细胞株细胞在相同的条件下培养7 d,在细胞培养的第4d开始产生明显差异。各耐药细胞株细胞增殖速度较原代细胞减慢， 生长斜率减小。表明各耐药细胞株细胞较原代细胞的倍增时间延长。 但各耐药细胞株细胞增殖能力表现相似。 说明氨甲喋吟对肿瘤细胞的 生长具有明显的抑制作用。2.3 采用2-/Ct法比较各模板中目的基因（RFCmRN A DHFR mRNA GST-% mRNA的相对含量。人骨肉瘤耐药细胞系 U2-OS/R1-R3 中 RFC

18、 mRN的表达为原代 U2-OS的 0.7 139、0.6 258、0.4 908 倍 （组间差别有统计学意义，P< 0.05 ）; U2-OS/R1-R3DHFR mRNA表达为原代U2-OS的5.3 145、12.8 937、30.6 501倍（组间差别有统 计学意义，P< 0.05）;U2-OS/R1-R3中 GST-兀 mRNA）表达为原代 U2-OS 的1.9 0813.5 420、4、8 319倍（组间差别有统计学意义，P&lt;0.05 ）. 图6为荧光定量PCFT增曲线。 图1光镜下U-2OS细胞（X 200）图2光镜下U-2OS/R1细胞（X 200）图3

19、光镜下U-2OS/R2 细胞（X 200） 图4光镜下U-2OS/R3细胞（X 200） 图5U2-OS及 U2-OS/R1-R3生长曲线 图6各细胞株 RFC DHFR GST-mRNA勺表达 荧光定量PCRT增曲线3讨论对骨肉瘤患者预后影响因素的探讨一直是临床医师关注的问 题。郭全义，卢世璧，张莉等1统计分析骨肉瘤患者84例，认为 接受化疗是影响患者预后的主要因素。MTX乍为最早公认的对骨肉瘤化疗有效的药物，具化疗耐药是造成临床骨肉瘤患者预后不良的主要 因素。关于骨肉瘤的MTX寸药的机制仍然没有完全阐明。 本试验通过 构建人骨肉瘤耐药细胞株，模拟临床骨肉瘤患者MTXt疗耐药过程，对骨肉瘤耐

20、药机制进行探索，筛选MT枇疗耐药指标，为进一步的基 因转染治疗提供体外试验模型。还原叶酸载体（RFC又称RFC-1、FOLT RFT-1或SLC19A1等 2,人类RFC是一个包含591个氨基酸的完整膜蛋白，分子量为6.4 487万区，有12个典型跨膜区的运输蛋白。Moscow 3分析 报道RFCS因突变导致的RFCS基酸序列和数量的改变使 RFC勺各个 跨膜区发生相应的改变，从而影响载体的活性和功能。RFO导的MTX 跨膜运输是MTXf入肿瘤细胞的主要途径，即MTX勺表达主要取决于 RFC表达和功能活性。Massimo Serra等4研究发现在人骨肉瘤 MTX寸药细胞株中RFC基因表达较原代

21、细胞株RFC基因表达降低。本 试验结果示耐药细胞株中RFCS因表达随耐药性增加而逐渐减少，结 果与上相似。二氢叶酸还原酶（DHFR是单体酶，在辅酶 NADPH勺参与下形成F-DHFR-NADP压元复合物，并将口t酸转换为体内 DNA RNA以及蛋白质生物合成所必需的原料，因而该酶对于生物体的新陈代谢具有 极为重要的作用。当MTX取代叶酸后，它与酶形成MTX-DHFRNADPH 三元复合物，就可以抑制核酸和蛋白质的合成，且MTX是二氢叶酸还原酶的天然底物，它与 DHFFW的亲和力比叶酸高105倍左右，因 此MTX勺抗肿瘤作用强而持久。本研究结果显示在人骨肉瘤 MTXt药 细胞株中DHFRS因表达

22、较原代细胞株 DHFRS因表达升高，且随细胞 耐药性的增加，DHFR基因的表达亦增加。本试验结果与 Scionti I5结果一致。谷胱甘肽S转移酶（GST是一组具有多种生理功能的二聚体蛋 白质。谷胱甘肽S转移酶（GST主要分布于人和动物的肝细胞浆中， 分为、区和兀。其中GST-兀被认为是多种肿瘤的标志物6。GST- 兀是通过水解 GSH与疏水性或亲电性复合物之间的连接而起细胞内 的解毒作用，成为肿瘤耐药的因素之一。目前有观点7认为化疗药物不能诱导GST-兀的表达，GST-兀的过表达可能是恶性细胞的表 型特性，提示化疗与GST-兀的表达可能不存在相关性，本研究结果不支持以上观点。国内 魏玲、宋现

23、让等8收集临床标本34例，研究发现骨肉瘤患者化疗 可引起GST-兀上调。与本试验结果部分相同。本试验采用实时荧光定量PC谡术，它具有探针杂交的高度特 异性并结合PCF术的高效核酸扩增、光化学技术的敏感及易定量等 优点，从扩增到结果分析均在 PCR反应管封闭状态下进行，解决了 PCFT物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了灵敏度，其结果用 拷贝数来表示，这种绝对数量更为准确，易于统一标准，便于不同试 验室之间进行比较 9。本试验采用实时荧光定量 PCR&,定量检 测了 RFC GST-%、DHFR mRNA人骨肉瘤细胞系及耐 MT北田胞系中 的表达，表明RFC GST-%、DHF廖与了人

24、骨肉瘤细胞 MTX药机制 的形成，为临床药物的研发提供了新的靶点。临床骨肉瘤患者MTX化疗的耐药可能受到年龄、性别、生活习 惯、病理类型等诸多临床因素的影响， 本试验通过体外建立骨肉瘤细 胞耐MTX莫型，提示临床骨肉瘤耐 MTX患者可能存在RFC DHFRGST- 兀基因表达的变化，研究 RFC DHFR GST-兀基因表达的变化，对于 推断临床骨肉瘤患者MTMt疗可能的耐药机制有重要的指导作用。 在 临床工作中对骨肉瘤患者进行检测 RFC DHFR GST-兀在基因或蛋白 水平的表达，有助于筛选MTXfc疗不敏感患者并对下一步的基因治疗 提供重要依据。但由于骨肉瘤细胞体外培养并不能完全模拟骨肉瘤在人体内的生长，故本实验结论尚待进一步临床验证【参考文献】1郭全义，卢世璧，张莉等.骨肉瘤的治疗及生存率的多因 素分析J.中国矫形外科杂志，2006, 7: 497-499.1 邓高荣，李书忠.还原性叶酸载体与骨肉瘤甲氨蝶吟化疗 J.国外医学：骨科学分册，2005,3:150-152.3 Moscow JA.Methotrexate transport and resistance J .Leuk Lymphoma, 1998, 3:215-224.4 Serra M.Analysis of dihydrofolate reductase and redu