12-基因工程ppt-第八章基因工程

1、第八章第八章 基因工程基因工程 基因工程基因工程 ( genetic engineering)、基因基因克隆、克隆、DNA重组、重组、 DNA克隆、分子克隆克隆、分子克隆 克隆（克隆（clone） 无性繁殖无性繁殖 应用酶学的方法，在体外将应用酶学的方法，在体外将目的基因目的基因与与载体载体DNA结合成一具有自我复制能力的结合成一具有自我复制能力的DNA分分子（子（复制子、重组体复制子、重组体），继而通过转化或转），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其

2、分子拷贝，或其表达产物表达产物。 基因克隆示意图基因克隆示意图 载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因宿主细胞重组体已转化的宿主细胞基因工程大事记基因工程大事记 1973 Cohen第一例成功的克隆实验第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司公司 人胰岛素人胰岛素 世界上世界上第一种基因工程蛋白药物第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物第一个基因工程药物-重组人胰岛重组人胰岛素在英、美获准使用素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国中国 转基因鱼转基因鱼 19931993 基因工程西红柿在美国上市基因工程西红

3、柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所英国罗斯林研究所 多莉羊多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作科学家公布人类基因组工作草图草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息公布人类基因组基本信息 生物技术工程：生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程酶工程、细胞工程*胰岛素胰岛素* 人生长激素人生长激素* 干扰素干扰素* 白细胞介素白细胞介素2* 粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子* 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子* 红细胞生成素红细胞生成素 EPO* 组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂* 生长激素生长激素* 促生长素促生长素* 抗血友病因子抗血友病因子* 脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶* 葡糖脑苷脂酶葡糖脑苷脂酶* 鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体自然界的基因转移和重组自然界的基因转移和重组 基因重组基因重组(genetic recombination)整整段段DNA在细胞内或细胞间在细胞内或细胞间,甚至不同物种甚至不同物种间进行交换间进行交换,并能在新的位置上复制并能在新的位置上复制,转录转录和翻译和翻译 自然界的基因转移和重组是无目的自然界的基因转移和重组是无目的 基因工程有目的

5、基因工程有目的 结合作用结合作用 质粒质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）个细胞（细菌） 转化作用转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程过程转导作用转导作用 transduction 病毒、噬菌体介导病毒、噬菌体介导 溶菌途径；溶原菌途径溶菌途径；溶原菌途径裂解溶原基因工程基因工程 工具酶工具酶 载体载体 重组重组DNA技术的基本过程技术的基本过程 真核细胞转染真核细胞转染 克隆基因的表达克隆基因的表达

6、工具酶工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶切割切割DNADNA连接酶连接酶生成生成3- 5磷酸二酯键磷酸二酯键DNA聚合酶聚合酶探针标记、补平探针标记、补平3末端末端反转录酶反转录酶cDNA合成合成多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记磷酸化、探针标记末端转移酶末端转移酶3末端多聚尾末端多聚尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基常用的工具酶：常用的工具酶：一把特殊的剪刀一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现阿尔伯阿尔伯( (ArberArber) )、史密斯史密斯( (Smith)Smith)和内森斯和内森斯( (NathansNathans) )，获获197

7、81978年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖 1953年，年，Arber研究噬菌体与细菌（研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。的关系。 发现发现100-200个子代噬菌体中，只有个子代噬菌体中，只有1个个可感染可感染B，即其他的噬菌体在即其他的噬菌体在B中受到限中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。感染成功。 细菌细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。死亡。 原因：细菌无法对自己的原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。进行修饰。 假设：限制性内切酶与修饰酶。假设：限制性内切酶与修饰酶。 1967年，年，Sm

8、ith，分析限制性内切酶的识别和分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由切割序列，认为它由5-6个碱基组成个碱基组成 原因：限制性酶将原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为切成平均长度为1000碱基的片段。碱基的片段。 识别和切割序列：中心对称的回文结构。识别和切割序列：中心对称的回文结构。 限制性酶：限制性酶：Hind Nathans：用限制性酶切割猴子用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。测序。C-A-Pu-Py-T-GC-A-Pu-Py-T-GG-T-Py-Pu-A-CG-T-Py-Pu-A-C55335533限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction enzy

9、me) 识别双链识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸内部特异位点并裂解磷酸二酯键二酯键 分类：分类：型、型、型型、型型 命名：命名： EcoR(E：属名；属名；co：种名；种名；R：株；株；：发现次序发现次序) 识别和切割位点识别和切割位点 回文结构回文结构 46 bp 出现两种末端出现两种末端*粘性末端粘性末端 粘端粘端 *平头末端平头末端 平端平端 同工异源酶：同工异源酶：来源不同，但能识别和切来源不同，但能识别和切割同一位点割同一位点 同尾酶：同尾酶：识别序列不同，但产生相同的识别序列不同，但产生相同的粘性末端粘性末端粘性末端与平头末端粘性末端与平头末端EcoRGAATTCCTTAAG5

10、533553355G GCTTAACTTAAAATTCAATTCG G333355粘性末端粘性末端SmaCCCGGGGGGCCC5533335555CCCCCCGGGGGGGGGGGGCCCCCC333355平头末端平头末端修饰酶修饰酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) T4DNA连接酶连接酶(T4 ligase) 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) Taq DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶

11、(pol )的活性 5至至3的聚合活性的聚合活性 5 3方向方向 核酸核酸 外切酶活性外切酶活性 5 3外切酶活性外切酶活性 3 5外切酶活性外切酶活性 pol 经经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段 大片段大片段 （Klenow片段片段）：聚合活性、）：聚合活性、 3 5外外切活性切活性 常用的工具酶核酸外切酶活性核酸外切酶活性 35外切酶活性外切酶活性 53外切酶活性外切酶活性53外切酶活性35外切酶活性5335末端脱氧核末端脱氧核苷酰转移酶苷酰转移酶(TDT)载体载体 vector DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和能在宿主细胞中进行自我复制和表

12、达表达 克隆载体、表达载体克隆载体、表达载体 原核载体原核载体：质粒：质粒(pBR322,pUC） 噬菌体（噬菌体（，M13）等等 真核载体真核载体：动物病毒载体：动物病毒载体pLXSN等等常用的克隆载体常用的克隆载体 质粒质粒(plasmid)存在于细菌染色体外的存在于细菌染色体外的小型环状双链小型环状双链DNA分子分子 理想的质粒理想的质粒 * 拷贝数多拷贝数多; * 两三个遗传标志，如抗药性基因：两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素抗氨苄青霉素基因基因(ampr) 、抗四环素基因抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因基因(lac Z) 筛选标志筛选标志* 多个限制酶的

13、单一切点，即多个限制酶的单一切点，即多克隆位点多克隆位点(multiple cloning sites,MCS) 四环素抗性基因氨苄青霉素 抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r) )(ter(terr r) )常用的克隆载体常用的克隆载体 噬菌体噬菌体(phage) 基因组分三个区域：左侧区、基因组分三个区域：左侧区、中间区中间区（非必需区）、（非必需区）、右侧区右侧区 DNA，替换型载体，外源替换型载体，外源DNA：923kb 常用：常用：EMBL 系列、系列、 gt 系列、系列、charon系列系列 粘性质粒粘

14、性质粒(cosmid)： DNA的的 cos区区+质粒，双质粒，双链环状链环状DNA，克隆容量：克隆容量：4050kb M13噬菌体噬菌体 最大优点：产生单链最大优点：产生单链DNAcos:cohesive-end site特点：特点：RF DNA:replicational form DNA优点：优点：表达载体表达载体(expressing vector) 特点：带表达构件特点：带表达构件转录和翻译所需的转录和翻译所需的DNA序序列列 大肠杆菌表达载体：含启动子大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位核糖体结合位点点克隆位点克隆位点转录终止信号转录终止信号 启动子：启动子：trp-lac(ta

15、c)启动子、启动子、噬菌体噬菌体PL启动子、启动子、T7噬菌体启动子噬菌体启动子 核糖体结合位点核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始起始密码子密码子(ATG)和和SD序列序列 转录终止序列转录终止序列哺乳动物表达载体哺乳动物表达载体 真核表达元件：启动子真核表达元件：启动子/增强子增强子克隆位克隆位点点终止信号和加终止信号和加poly(A)信号信号重组重组DNA技术的基本过程技术的基本过程 目的基因的制备目的基因的制备 载体的选择和制备载体的选择和制备 DNA分子的体外连接分子的体外连接 将外源将外源DNA导入宿主细胞导入宿主细胞 目的基因的筛选和鉴定目的

16、基因的筛选和鉴定目的基因目的基因(target DNA)的制备的制备 目的基因（外源基因）目的基因（外源基因） 制备基因组制备基因组DNA 基因文库基因文库(genomic library)存在于转化细菌存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合的集合 制备制备cDNA cDNA文库文库(cDNA library) 制备用于表达的基因片段：制备用于表达的基因片段：PCR技术、化技术、化学合成学合成RNA模板杂化双链单链DNA双链DNA反转录酶RNaseH碱水解DNA聚合酶整合S1核酸酶细胞内复制试管内合成反转录酶反转录酶载体的选择和制备：载体的选择和制备

17、：噬菌体、粘性质噬菌体、粘性质粒、粒、 pUC系列、系列、M13噬菌体噬菌体DNA分子的体外连接（分子的体外连接（DNA连接酶）连接酶） 粘性末端连接粘性末端连接 连接效率高连接效率高*相同酶切末端相同酶切末端平端连接平端连接 连接效率低连接效率低人工接头人工接头(linker)法法同聚物接尾法同聚物接尾法同聚物接尾法同聚物接尾法目的基因载体DNA+dGTP+dCTPPolyGPolyC3333将外源将外源DNA导入宿主细胞导入宿主细胞 基因工程菌基因工程菌 HB101,JM109 转化转化(transformation) 制备制备感受态细胞感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适冷的氯化钙处

18、理，细胞处于最适摄取和容忍外来摄取和容忍外来DNA的生理状态的生理状态 感染感染(infaction) 转导转导(transduction) ：由噬菌体和细胞病毒介导的遗由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程传信息转移过程 转染转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动真核细胞主动摄取或被动导入外源导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。片段而获得新的表型的过程。目的基因的筛选和鉴定目的基因的筛选和鉴定(screening/selection) 遗传学方法遗传学方法 插入灭活法插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择抗药性标志选择 标志补救标志

19、补救 表达产物与营养缺陷互补表达产物与营养缺陷互补 * -互补互补 蓝白斑蓝白斑筛选筛选 免疫学方法免疫学方法 分子杂交分子杂交 探针探针 原位杂交原位杂交 PCR 限制性酶切图谱限制性酶切图谱 IPTG;X-gal(5- 溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷) bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 克隆基因的表达克隆基因的表达 载体有转录、翻译的元件；载体有转录、翻译的元件； 密码子通用密码子通用 原核表达体系原核表达体系 原核表达载体的标准原核表达载体的标准*合适的筛选标志合适的筛选标志*强启动子强启动子*翻译控制序列翻译控制序列*多克隆位点多克隆位点融合蛋白（融合蛋白（fusion protein,包涵体）包涵体）表达的蛋白质或多肽的表达的蛋白质或多肽的N末端由原核末端由原核DNA编码，编码，C末断由克隆的真核末断由克隆的真核DNA编目。编目。大肠杆菌表达体系的不足大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制，只能表达缺乏