完整版膜蛋白提取

1、1别离组织膜蛋白的方法1、取组织,参加 10ml Buffer A 于冰上充分匀浆.2、J6-HC离心机800rpm , 4 c离心10min后,所得上清液转入超速离心管.3、100000g , 4c离心1hr.弃去上清,沉淀用适量的 Buffer B重悬,冰上孵育2hr后分装 至 EP 管, Eppendorf 台式离心机 10000rpm , 4 c离心 30min.4、收集所得上清液即为膜组份.Buffer A : 0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl (PH 7.5), 120mM KCl , 1mM EDTA,1mM EDTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupep

2、tin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B : 20mM HEPES (PH 7.5 ) , 10% 甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.2取约0.1g肝组织,参加2ml粉碎缓冲液,冰浴中超声粉碎,每次 20秒,间隔30秒,共3 次,4° c 105xg条件下离心2小时,上清液为胞浆蛋白,沉淀局部参加1ml胞膜蛋白提取液,超声粉碎

3、,4.c 105xg条件下离心2小时,上清液为 胞膜蛋白.样品蛋白含量测定采 用酚试剂法.3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1 .将细胞种于 T75或T175的培养瓶中培养数天,细胞铺满瓶底后,吸去培养液.将 PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%) 参加量以覆盖细胞为止,置于培 养箱或在超净台内消化 35分钟,如仍未脱落瓶底,用吸管吹打,使细胞完全脱落.2 .收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中,1000rpm离心10分钟,去上清液.3 . 按2.5毫升(T75 ) /每瓶或5毫升(T175/每瓶参加冰冷的匀浆液 (HEPES:50

4、mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM )于离心管中,将溶液和沉淀转移到匀浆器 中,匀浆.4 .将匀浆液转入离心管中, 参加适量的 Tris - HCl (50mM, PH7.4)4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟.在沉淀中参加同前量的匀浆液,再匀浆,匀浆后参加适量的tris-HCl buffer. 4度18000rpm(40000g)离心,共离心三次.5 .在最后一次离心彳#到沉淀中按250微升每瓶(T75)或500微升每瓶(T175)参加tris-HClbuffer,匀浆,取50微升匀浆液测量蛋白浓度.6 .按实验要求,将匀浆分装于1毫升的Eppendo

5、ff管中,其于-80oC冰箱中待用.主要基于膜蛋白分子量较大,在40000g时易沉降来别离.做膜蛋白的免疫荧光, 可以用荧光抗体染色, 然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察,具体的protocol可以找到,就不多说了.需要注意的是,要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域,如果是胞外,可以直接染色；如果在胞内,那么需要用无水甲醇在-20度处理10min,使细胞膜通透,然后再用抗体孵育,这样抗体才能进入细胞 内与蛋白结合.一般对膜蛋白的提取都是采用梯度离心或者高速离心的方法别离,可是我们现有的离心机都无法到达所需要的转速,所以我们试着采用分布溶解分布沉淀的方法.1)预冷的

6、pbs洗去组织血液,除去结缔组织、脂肪.2) 4 C剪碎,加bufferA玻璃匀浆器匀浆至无大块状物,10 C超声波10min ,重悬,再破碎 510min.3) 12000rpm 离心 10min,沉淀用 bufferB 重悬,20 C超声波 10min.4) 12000rpm 离心 10min,沉淀用 bufferC 抽提.5) 12000rpm离心10min,所得上清含有 9%的膜蛋白.6) 12000rpm离心10min,沉淀加 bufferD沸水煮5min , 12000rpm离心10min,上清含有 1%的膜蛋白.bufferA: 40mM Tris basebufferB: 8M

7、 urea ,100mM DTT, 40mM Tris basebufferC: 6-7M urea, 0.2mmol/L PMSF,40mM Tris basebufferD: 1% SDS, 50mM DTT,25%Glycerol,in 0.4M Tris-HCl pH8.8我们做的是动物组织的膜蛋白,提出来电泳条带还可以,只是我们没有专一膜蛋白抗体来检测 提出来的是否是膜蛋白.但是这个方法是可行的5三、 蛋白提取操作步骤I实体组织蛋白的提取1、 组织样本(200300mg)尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织,于冰上剪碎；2、组织样本中参加 1mL Lysis Buffer (注：使

8、用前,每 mL Lysis Buffer参加1科L蛋白酶抑 制剂和1科L 1M DTT ),置玻璃均浆器冰上均质3050次(或超声破碎细胞, 每次30 S ,34次,每次间隔1 min),置于冰上冷却.均质或超声破碎细胞后应镜检,细胞破碎率不 小于90%;3、 将均浆液转移至冷的离心管中,于 4C, 3000 rpm离心10 min,弃沉淀；4、取上清转移至新冷离心管中,于 4 C , 14 000 rpm离心30 min ,所得上清转至新管中, 即为胞浆蛋白,分装冷冻保存；5、 取沉淀,参加1mL冷的抽提Buffer,涡旋振荡混匀后,4c放置1015min；【注：因抽提Buffer在室温时会

9、分层,请务必于4c混匀后参加】6、4 , 3000rpm离心5min ,取上清转移至新管(注意勿将沉淀带入上清),进行下步提取;7、 置于37 c水浴10min；8、 室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层含膜蛋白；【注：建议使用进口透明性较好的微量离心管,可见下层为含膜蛋白的有机相. 上下两层因均为透明,只在交界处有一折光线,需仔细观察才可见到.或室温静置30分钟1小时亦可见分层.以下亦同.】9、 取下层,参加 500d L冰冷灭菌水,4c放置5min； 10、置于37 c水浴10min； 11、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层含膜蛋白 ；12、

10、取下层,参加 500d L冰冷灭菌水,4c放置5min；13、置于37 c水浴10min；14、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层含膜蛋白；15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物,BCA法测定蛋白含量因残留有机相可能影响测定结果,此含量为相对参考值,分装冷冻保存.6用RIPA强配方,把脱氧胆酸钠浓度调整至1.0%,同时参加 NP-40和Triton X-100 ,浓度均为1%.我刚做了一个 7次跨膜蛋白,LHR的WB.7提取总蛋白的方法不能用于膜蛋白的提取, 提供一个常用的方法：先别离膜,在提取膜蛋白. 这类方法在园子里有不少介绍. 我们实验室曾经采用蔗糖梯度超速离心别离

11、膜,据说效果还可以.您可以试一下.呵呵 8细胞破碎后,先低速离心,除去未破碎的细胞和大的细胞碎片.保存上清,超速离心,可获 得细胞膜.然后用 detergent溶液萃取,就可以得到膜蛋白溶液了.9我有新的问题了.哪位仁兄有好的提取细胞膜蛋白的裂解液配方.我的膜蛋白总提不出来.我的细胞是HEPG2;目的蛋白是LDL受体；我的配方是这样的：4%CHAPS , 8 mol/L urea, 0.1 mmol/L leupeptin, and 1.5 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride但是总提不出来.急！ ! ! ! !呵呵,CHAPS提取膜蛋白水平较差,尝试参加1

12、%ASB-14 ,或者参加1 % Triton X-100,与CHAPS联合抽提.另外最好参加 2M thiourea.祝好运1.6% Triton X-100, 5 mol/L urea, 0.1 mmol/L leupeptin, and 1.5 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride ;2M thiourea;thiourea很贵吗？我现在没有,又要急着用,能不能不用thiourea?thiourea不是很贵,merck250g才300多rmb.电泳时可以考虑用 ASB-14 , sb3-10.没有的话,提取最好加点 NP-40, 2M thiourea

13、还是要的,要是有 TBP就更好了.NP lysis buffer.NP 配方,stock solution 20ml (50mM Tris-HCL (PH8.0), 5mMEDTA, 0.05%NaN3, 0.14M NaCL, 100mM NaF), 1% Nonidet P40, 0.2TIU/ml aprotinin, 1.5uM pepstatin A, 20mM Iodoacetamide.NP配好后分装,-80度保存.用之前,参加 NaV和PMSF.混匀后立即置于冰上.10如果你研究的蛋白表达比拟丰富没有必要提取膜蛋白,直接用RIPA裂解液裂解后离心取可溶性蛋白变性做 WB就可以了

14、；如果你蛋白的含量低或抗体特异性很差的话,你应该用试剂盒或超速离心提取膜蛋白,可以起到富集和纯化的作用,使你更容易得到好的结果！11RAPI的裂解液只能说是强的非变性裂解液,而算不上是强的变性裂解液 .提取膜蛋白一般都在变性条件下才可以.所以,你应该改用其他更适合的强的变性裂解液,如含SB3-10、DM、ASB-14等膜助溶剂,或者 SDS-Bolied loading bufffer,2-D 裂解液 7M thiourea+2M urea 也可以12组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行(1)取组织,用 PBS冲洗干净组织上的血液.参加10ml Buffer A ,用剪刀尽可能剪 碎组 织,于冰上

15、充分匀浆.每次30秒,重复3-5次.(2)离心机1000rpm , 4 C离心10min后,所得上清液转入超速离心管.(去掉大块组织及结缔组织)(3) 100000g, 4c离心1hr,弃去上清.(此为胞浆蛋白,假设只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4 度,30分钟离心,取上清即可 ).沉淀用适量的 Buffer B重悬,4度过夜后,分装至EP管, Eppendorf 台式离心机 10000rpm, 4 C 离心 30min.(4)收集所得上清液即为膜组份.Buffer A :0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl (PH 7.5), 120mM KCl , 1mM EDTA, 1m

16、M EGTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B 20mM HEPES (PH 7.5), 10% 甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM , PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.所得蛋白分装EP管(每管约50ul),取一管测蛋白浓度,其它放入-70度深冻冰箱保存.如果要定量的话,最好能立即根据浓度,参加上样缓冲,煮沸,

17、 4度保存.反复冻融蛋白会 降解,浓度不准.13我用来抽提大鼠脑组织细胞膜蛋白方法：取两只大鼠的整个脑组织,参加10ml Buffer A 于冰上充分匀浆.J6-HC离心机800rpm , 4 C离心10min后,所得上清液转入超速离心管.100000g, 4c离心1hr.弃去上清,沉淀用适量的Buffer B重悬,冰上孵育 2hr后分装至EP管,Eppendorf台式离心机10000rpm, 4 C 离心30min.所得上清液即为膜组份.Buffer A : 0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl PH 7.5,120mM KCl , 1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mMPM

18、SF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B ： 20mM HEPES PH 7.5, 10%甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin . 冰上预冷.CHAPS一种离子去污剂是提取膜蛋白的常用试剂一般用10mMol的浓度即可,你可以试试加到你的Buffer中,看效果如何.不过此药品很贵！lysis buffer的选择依赖于你

19、所研究蛋白质的位置和性质：1细胞浆蛋白可溶性：Tris Buffer2细胞浆蛋白结合到细胞骨架：Tris-Triton buffer3膜结合蛋白：Np-40或RIPA4核蛋白：RIPA5线粒体蛋白：特殊的抽提裂解液6全细胞蛋白：Np-40 or RIPAWestern blotAdipose tissue membrane protein was extracted from approx. 20mg of adipose tissue. PAGE was performed according to Laemmli 8. A portion of 2 g of adipose t issue

20、 membrane protein was applied per lane. In addition, 10 q of mononuclear cell membrane protein corresponding to 1.7 106 mononuclear cells was applied and used as a positive control for verification of blotting, incubation and detection. Tank blotting to nitrocellulose was performed according to stan

21、dard protocols, with transfer for 3h at 70V and 15 C.°The blots were incubated with 1 闵/ml rabbit anti-human b2-adrenoceptor IgG Santa Cruz Biotechnology Inc., and were then re-incubated with alkaline phosphatase-labelled goat anti-rabbit antibody. Detection was performed using DDAO 9H-(1,3-dic

22、hloro-9,9-dimethylacridin-2-one-7-yl) phosphate (Pro-Q Western Blot Stain Kit; Molecular Probes Inc.) on a Fujifilm FLA-3000 instrument.Quantification of b2-adrenoceptor protein was performed by determining the fluorescence intensity of b2-adrenoceptor-antibody-immunoreactive bands. The concentratio

23、n of b2-adrenoceptor protein is expressed as the intensity of the immunoreactive bands of the tissue samples in relation to the intensity of the immunoreactive bands of the mononuclear cell membrane protein internal standard. Like others before us trying to isolate the b2-adrenoceptor 9, we observed

24、 several immunoreactive bands on our Western blots ( Figure 1). On all blots we found a single major band at 57kDa and several smaller immunoreactive bands (38-52kDa). Theb2-adrenoceptor is known to have a molecular mass of 64kDa and to be very fragile, so the immunoreactive bands on our blots must

25、represent proteolytic degradation products and/or secondarily modified b2-adrenoceptor. When trying to quantify the receptor it is therefore uncertain whether to include all visible bands total band area (T) or to include only the single major band (S). We have done both. Figure 1 shows the area inc

26、luded in determining the intensity of the single major band and total band area intensity.All blots were loaded with the same amount of membrane protein per well, but since we wished to determine the level of protein expression in relation to individual cells, the concentration is expressed as inten

27、sity of b2-adrenoceptor protein per ng of DNA. The coefficient of variation based on 13 double determinations was 28% for total band area determinations and 29% for single major band determinations14凯基膜蛋白提取试剂盒凯基膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒一、描述：本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白.其原理是裂解细胞后,先 离心别离出质膜粗提物,再利用特殊的抽提Buffer,选择性地别离提取膜

28、蛋白,抽提 Buffer含一种特殊的去污剂,在4c时所有的蛋白质均可都溶于抽提Buffer,但在37c时,抽提Buffer分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中,根楣 该性质别离出膜蛋白.产物不仅含细胞膜蛋白,也含胞器质膜蛋白.提取方法简单,可靠, 快速.获得的膜蛋白纯度高,可用于 PAGE电泳、 Western Blot、免疫共沉淀等后续研究. 二、试剂盒组份组份KGP350 (50 tests )KGP3100 (100 tests )Lysis Buffer50 mL25 mLX 4抽提Buffer50 mL25 mLX 4蛋白酶抑制剂50V L100g L

29、溶解Buffer15 mL30 mLTCA试齐5 mL10 mLLoading Buffer1 mL2 mLDTT(1M)50V L100g L三、 蛋白提取操作步骤I实体组织蛋白的提取1、 组织样本200300mg尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织,于冰上剪碎；2、组织样本中参加 1mL Lysis Buffer 注：使用前,每 mL Lysis Buffer参加1科L蛋白酶抑 制剂和1 L 1M DTT ,置玻璃均浆器冰上均质3050次或超声破碎细胞,每次 30 S ,34次,每次间隔1 min,置于冰上冷却.均质或超声破碎细胞后应镜检,细胞破碎率不 小于90%;3、 将均浆液转移至冷

30、的离心管中,于 4C, 3000 rpm离心10 min,弃沉淀；4、取上清转移至新冷离心管中,于 4 C , 14 000 rpm离心30 min ,所得上清转至新管中, 即为胞浆蛋白,分装冷冻保存；5、 取沉淀,参加1mL冷的抽提Buffer,涡旋振荡混匀后,4c放置1015min； 【注：因抽提Buffer在室温时会分层,请务必于4c混匀后参加】6、4 , 3000rpm离心5min ,取上清转移至新管注意勿将沉淀带入上清,进行下步提取；7、 置于37 c水浴10min；8、 室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层含膜蛋白；【注：建议使用进口透明性较好的微量离心管,可见