分子生物学相关概念

1、精品文档1实时荧光PCR技术：利用荧光定量PCR扩增仪进行的PCR技术被称为荧光 定量PCR技术，又称实时PCR技术，它通过对反应体系中荧光信号的检测实现 了对PCR过程中产物量的实时监测，并根据参照系统较为精确地计算出 PCR的 初始模板量。2熔点温度(Tm值)：Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的 DNA , Tm值不同。DNA中G C含量越高，Tm值越高，成正比关系3多重PCR:是在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中同一靶基因多个不同序列的片段(或多个不同靶基因的片段)的技术。4 Taqman荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的

2、同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核甘酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。5 Ta克隆：T-A克隆法就是用改良碱裂解法抽提 pBluescript SK(+)质粒，用EcoRV将pBluescript SK(+)质粒切成平端，利用Taq DNA聚合酶及dTTP制备pBluescript S

3、K(+) T-A 载体.将 伊actin cDNA 片段克隆入自制的 pBluescriptSK(+) T-A载体，经EcoR I及Hind in双酶切得到与设定长度一致的,actincDNA片段.6探针：之所有能与特定的靶分子发生特异性的相互作用，并可以被检测的分子。7限制性内切酶：是能识别和水解双链 DNA分子内特异序列的核酸水解酶类。存在于细菌体内，并与相伴存在的修饰酶共同构成细菌的限制一修饰体系，起限制外来DNA、保护自身DNA的作用。简单1基因重组的技术路线一是目的基因的获取二是目的DNA片段与载体的连接三是重组DNA分子导入宿主细胞；四是重组子的筛选与鉴定2限制性内切酶的识别位点通

4、常为4、5或6个核甘酸长度的序列且呈二元旋转对称(回文结构)，产生5'黏性末端或3'黏性末端，但有少量酶识别更长的序列或简并序列、3 PCR技术模板制备的基本要求模板包括基因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体DNA等(1)模板DNA需要有较高的纯度，过多的 RNA污染会造成RNA与DNA的杂交或RNA与引物的杂交，导致特异性扩增产物的减少和非特异性 产物的增多。(2)单双链均可，但不能混有蛋白酶，核酸酶，DNA聚合酶抑制剂，DNA结合蛋白类等。(3) 在用 RNA 作为模板时，须先将RNA 反转录为，再以 cDNA 作为 PCR反应的模板进行扩增反应(4) 常规 PCR 的模

5、板 DNA 量一般仅需50100ng 左右。4 在基因组 DNA 分离纯化过程中怎么样保持完整性影响核酸完整性的因素物理因素1 .机械性剪切强力高速的溶液振荡、搅拌；溶液快速通过狭长的孔道；细胞突然置于低渗液中爆炸式破裂；DNA 溶液的反复冻融2 .高温长时间煮沸化学因素：强酸，强碱生物因素：核酸酶保证核酸完整性，除了尽量避免以上因素，还应做好以下的措施04 c低温操作提取高分子线性DNA 分子时小心操作缓冲液的酸碱度控制在pH410之间尽量简化纯化步骤，缩短提取时间使用核酸酶抑制剂：如金属螯合剂(EDTA 、柠檬酸盐)、SDS 、蛋白酶5 PCR 底物设计原则，分析影响的原因?两条引物分别位

6、于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补?长度为1825个核甘酸?二条引物之间避免形成引物二聚体?引物浓度：0.10.2 pmol/L ,浓度过高容易生成引物二聚体?引物的碱基组成应平衡，C+G碱基含量在引物中的比例一般以 45% 55%为宜? 引物退火温度计算：Tm=2 （A+T ） +4 （C+G）?引物的5'端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）6蓝白斑筛选原理大肠杆菌B-半乳糖普酶可分成2部分即“肽段（N-端的146个aa）和C-段。a肽段的 基因位于载体上并含有不影响其 ORF （open reading ）的多克隆位点（MCS ）,而C-段的基因位于工程菌

7、E. coli DH5 a上。二者在同一菌株中表达时，菌株中的 C-段与 载体上的a肽段互补而具有酶活性，能将无色化合物 X-gal（5-澳-4-氯-3- 口引噪-3-D-半乳糖甘）切割成半乳糖和深蓝色的物质 5-澳-4-靛蓝。在MCS上插入新基因将会改变其ORF而使得载体上的a肽段不能与菌株中的 C-段互补而不能无色化合物 X-gal（5-澳-4- 氯-3-回噪-B-D-半乳糖甘）切割成半乳糖和深蓝色的物质 5-澳-4-靛蓝产生白斑。选择转 入的阳性克隆即选择白斑。7 PCR标本需不需要纯化，为什么？灵敏度高，特异性强，对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床 标本如血液、体腔液、 洗嗽液、毛发、细胞、活组织等 DNA扩增检测。8 PCR 技术中如何控制假阳性和假阴性假阳性及防治：污染主要来自：扩增产物的污染（为主要来源），试剂及器材污染、标本间的交叉污染 、实验人员的污染等。污染的防治：主要方法有两种（ 1 ）规范化的实验操作，良好的实验环境（